王顏波 常英英 梁立雄 蘇曉華 張冰玉 楊帆 劉秀華 王建革

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，南昌，330045) (林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所)) (江西農(nóng)業(yè)大學(xué))

責(zé)任編輯:潘 華。

穩(wěn)定高效的再生體系是遺傳轉(zhuǎn)化的重要前提。楊樹(shù)是我國(guó)重要的栽培樹(shù)種，在世界上也占有重要地位。一般說(shuō)來(lái)，白楊派樹(shù)種的組培再生體系已經(jīng)較為成熟，黑楊派樹(shù)種則相對(duì)較為困難。近年來(lái)，黑楊派樹(shù)種的再生及遺傳轉(zhuǎn)化已在國(guó)內(nèi)外科學(xué)家的努力下取得了巨大進(jìn)步［1-5］。于志水等［6］探索了黑楊派樹(shù)種組培體系，通過(guò)不同外植體分化得到無(wú)菌苗，并且篩選了培養(yǎng)基配方，得到了繼代和生根苗。康薇等人［7］篩選出了美洲黑楊(Populus deltoides)離體葉片分化和生根的最適培養(yǎng)基，建立了組培再生體系。周洲［8］等人采用蛭石為基質(zhì)，使歐美楊108(Populus × euramericana)、歐美楊2001(Populus ×euramericana)、歐美楊107(Populus ×euramericana)生根，并顯著提高生根苗繼代培養(yǎng)和移栽成活率。崔旭東等［9］還發(fā)現(xiàn)卡那霉素可以抑制渤豐1 號(hào)楊(Populus×euramericana cl.‘Bofeng 1’)葉片的誘導(dǎo)與分化，增加Cu2+質(zhì)量濃度能顯著促進(jìn)渤豐1 號(hào)楊不定芽的誘導(dǎo)和分化。

在楊樹(shù)育種資源中，黑楊派樹(shù)種是重要基因供體。本研究以歐洲黑楊N46 無(wú)性系的腋芽無(wú)菌萌發(fā)的幼嫩葉片為試驗(yàn)材料，研究了不同激素組合配比、培養(yǎng)溫度等因素對(duì)不定芽誘導(dǎo)和生根的影響，建立了無(wú)性系的再生體系，為楊樹(shù)快速繁育和遺傳改良提供借鑒。

1 材料與方法

2014年4月自中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院科研溫室中采取生長(zhǎng)健壯無(wú)病的1年生歐洲黑楊N46 無(wú)性系含腋芽的莖段，消毒后在MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取腋芽無(wú)菌萌發(fā)的幼嫩葉片作為試驗(yàn)材料。

取含腋芽的莖段，流水沖洗2 h，75%乙醇處理1 min;接著用含0.02% tween-20 的2% NaClO 液中處理10 min，最后用無(wú)菌水沖洗4 次。接種于不加任何激素的MS 培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。

最適分化培養(yǎng)基的選擇:待MS 培養(yǎng)基上莖段上的腋芽萌發(fā)至3～4 cm 時(shí)，取生長(zhǎng)健壯的腋芽自上而下第3、4 個(gè)葉片，切去邊緣，正面朝下平鋪于分化培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基成份采用正交設(shè)計(jì)4 因素3 水平L9(34)表設(shè)計(jì)，共9 個(gè)處理，每個(gè)處理接種10 個(gè)無(wú)菌葉片，3 次重復(fù)。暗培養(yǎng)48 h 后，轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)。光照強(qiáng)度2 300 lx，光周期16 h/8 h。每7 d 觀察1 次，培養(yǎng)21 d 后統(tǒng)計(jì)不定芽的分化情況。

最適生根培養(yǎng)基的選擇:選取生長(zhǎng)健壯且長(zhǎng)度大于1 cm 的不定芽接種在生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基成份采用正交設(shè)計(jì)4 因素3 水平L9(34)表設(shè)計(jì)，共9個(gè)處理，每處理10 個(gè)不定芽，3 次重復(fù)。7 d 后每天觀察1 次，第15 d 統(tǒng)計(jì)不定芽的生根情況。

再生苗的移植:當(dāng)組培苗高度達(dá)10 cm 時(shí)，在自然條件下封口煉苗3 d，之后用鑷子將苗小心取出，然后用清水洗去根部培養(yǎng)基，用1.5%多菌靈溶液浸泡1 min，再將其移植到拌有1.5%多菌靈溶液的V(草炭土)∶ V(珍珠巖)=5∶ 1 的基質(zhì)中，澆透水，并用塑料薄膜罩于營(yíng)養(yǎng)缽上保濕。15 d 后，揭去塑料薄膜進(jìn)行培養(yǎng)，30 d 后統(tǒng)計(jì)成活率。

存活率=(存活的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%;生根率=(生根的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%。采用SPSS17.0 對(duì)試驗(yàn)觀測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析，在F0.05水平上進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)后，用新復(fù)極差(SSR)法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適分化培養(yǎng)基的選擇

葉片接入7 d 后，葉片出現(xiàn)卷曲，葉脈處出現(xiàn)膨大，葉片邊緣傷口處出現(xiàn)淡黃色愈傷，個(gè)別呈現(xiàn)淡綠色。14 d 后，愈傷組織顏色加深，不定芽開(kāi)始形成。21 d 后不定芽大量出現(xiàn)，單芽、雙芽和叢生芽均有。不同分化培養(yǎng)基對(duì)不定芽誘導(dǎo)的結(jié)果及多重比較見(jiàn)表1。

表1 不同分化培養(yǎng)基對(duì)不定芽誘導(dǎo)的結(jié)果

根據(jù)表1中Ki(其中一個(gè)因素水平號(hào)為i 時(shí)分化芽數(shù)的平均值)值可知，6-BA 質(zhì)量濃度從0.8下降到0.3 mg·L-1過(guò)程中平均分化不定芽數(shù)先上升后下降，在6-BA 質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1時(shí)最高;NAA 質(zhì)量濃度在從0.08 到0.03 mg·L-1過(guò)程中平均分化不定芽數(shù)呈上升趨勢(shì);隨著溫度的上升，不定芽數(shù)先下降后上升，在27 ℃時(shí)最高，凝固劑瓊脂粉中分化不定芽數(shù)略微高于植物凝膠。根據(jù)各因素3 個(gè)水平的極差R 判斷，4 個(gè)因素對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響程度為A ＞B ＞C ＞D。依據(jù)表中的Ki的最大值可知，最適分化培養(yǎng)基為:A2B3C3D2，即MS +6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.03 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+0.5%瓊脂粉，最佳誘導(dǎo)溫度為27 ℃(見(jiàn)圖1)。

2.2 最適生根培養(yǎng)基的選擇

不同生根培養(yǎng)基對(duì)不定芽生根的影響的結(jié)果見(jiàn)表2。將1.5 cm 長(zhǎng)左右的不定芽切下，接入生根培養(yǎng)基。在5 d 后開(kāi)始多數(shù)處理出現(xiàn)乳白色根點(diǎn)，8 d后，第7、8、9 處理的根清晰可見(jiàn)，根數(shù)在6～10 條不等。15 d 時(shí)第9 處理的根長(zhǎng)可達(dá)4～5 cm，主根明顯，須根茂密。

根據(jù)表2中ki值可知，IBA 與NAA 質(zhì)量濃度在從0.1 降到0.01 mg·L-1過(guò)程中生根率均呈上升趨勢(shì);隨著溫度的上升，生根率先上升后下降，在25 ℃時(shí)最高，凝固劑瓊脂粉中生根率略微高于植物凝膠。依據(jù)各因素3 個(gè)水平的極差R 判斷4 個(gè)因素的影響程度為A ＞B ＞C ＞D，根據(jù)表中的Ki的最大值可知，最佳分化培養(yǎng)基為:A3B3C2D2，即1/2MS +IBA0.01 mg·L-1+NAA0.01 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+ 0.5%瓊脂粉，最佳生根溫度為25 ℃(見(jiàn)圖1)。

圖1 最佳培養(yǎng)基上不定芽的誘導(dǎo)和生根情況

表2 不同生根培養(yǎng)基對(duì)不定芽生根的影響

3 結(jié)論與討論

本研究建立了歐洲黑楊N46 無(wú)性系高效穩(wěn)定的不定芽誘導(dǎo)和植株再生體系:幼嫩葉片進(jìn)行不定芽分化誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS +6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.03 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂粉5 g·L-1，誘導(dǎo)最佳溫度為27 ℃，每個(gè)葉片平均分化不定芽數(shù)量可達(dá)45.20 個(gè);不定芽生根的最佳培養(yǎng)基為1/2MS + IBA0.01 mg·L-1+NAA0.01 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂粉5 g·L-1，生根最佳溫度為25 ℃，生根率可達(dá)93.33%，生根小植株移栽成活率達(dá)98%。

培養(yǎng)基中激素的種類及配比是影響外植體分化和不定芽誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素，調(diào)節(jié)其水平及配比是建立和優(yōu)化再生體系的有效手段［10］。有研究認(rèn)為，培養(yǎng)基中激素的相對(duì)含量控制植物不定芽的分化及器官形成，并非其絕對(duì)含量［11］。然而一些針對(duì)楊屬植物不定芽誘導(dǎo)的研究結(jié)果迥異，激素的絕對(duì)含量相差無(wú)幾，而相對(duì)含量相差甚大。王金貴［12］篩選出的的俄羅斯抗寒楊(Populus alba)不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-BA 與NAA 的絕對(duì)質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1和0.2 mg·L-1。崔莉潔［13］等人研究來(lái)源于阿塞拜疆共和國(guó)巴庫(kù)地區(qū)的歐洲黑楊(Populus nigra)最適的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-BA 與IBA 的絕對(duì)質(zhì)量濃度為1 mg·L-1和0.25 mg·L-1。崔旭東［9］研究的歐美楊渤豐1 號(hào)分化培養(yǎng)基中6- BA 與NAA 的絕對(duì)質(zhì)量濃度為0.4 mg·L-1和0.04 mg·L-1。本研究中歐洲黑煙N46 最適的分化培養(yǎng)基中6-BA 與NAA 的絕對(duì)質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1和0.03 mg·L-1。激素6-BA 的質(zhì)量濃度在0.4～1.0 mg·L-1，NAA 的質(zhì)量濃度在0.03～0.2 mg·L-1，絕對(duì)質(zhì)量濃度相差不大，而相對(duì)質(zhì)量濃度相差懸殊，從2.5 倍到17 倍不等，均取得了良好的分化效果。由此可見(jiàn)，培養(yǎng)基中激素的相對(duì)質(zhì)量濃度和絕對(duì)質(zhì)量濃度均是不定芽誘導(dǎo)的影響因素，其種類及配比因物種而異。

對(duì)于不定芽的生根培養(yǎng)基存在不同的觀點(diǎn)，均取得了良好的生根效果。洪震［14］等人在研究秀麗野海棠葉片不定芽生根時(shí)，使用MS 培養(yǎng)基取得了良好的效果。崔旭東［10］發(fā)現(xiàn)渤豐1 號(hào)楊在1/2MS的培養(yǎng)基中生根效果最好。任如意［15］使用1/4MS培養(yǎng)基培養(yǎng)藥用植物北玄參，生根率達(dá)100%，平均生根數(shù)為11.33。不過(guò)，崔莉潔［13］等人比較歐洲黑楊在1/2MS 與MS 培養(yǎng)基上的生根效果，結(jié)果表明1/2MS 培養(yǎng)基生根效率和效果明顯優(yōu)于MS 培養(yǎng)基。金華等［16］人利用741 楊的培養(yǎng)結(jié)果支持上述觀點(diǎn)。

本研究采用無(wú)機(jī)離子減半的1/2MS 培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，不定芽8 d 即可生根，生根率可達(dá)93.33%。由此可見(jiàn)，采用無(wú)機(jī)離子減半的1/2MS培養(yǎng)基更有利于歐洲黑楊生根。再生體系是遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)，而遺傳轉(zhuǎn)化是培育轉(zhuǎn)基因新品種的有效途徑。本研究建立了歐洲黑楊N46 無(wú)性系的組培再生體系，為黑楊快速無(wú)性繁殖及遺傳轉(zhuǎn)化提供了借鑒。

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