袁柳祥 李厚華 賈彩霞 徐曼 唐豆豆 劉小微 包努恩都特

(西北農林科技大學，楊凌，712100) (武漢設計工程學院) (西北農林科技大學)

責任編輯:潘 華。

蘋果屬植物(Malus)主要分布于北溫帶，其野生種主要分布在東南亞、西亞、東亞、歐洲、北美這5大基因分布中心，我國是蘋果屬植物起源中心之一［1］。海棠是蘋果屬植物中果實直徑小于5 cm 的類型［2］。海棠中存在著許多果實的果皮和果肉同為紅色的類型。這些紅色物質，主要為花青苷。花青苷是是一種黃酮類色素，具有抗氧化作用［3］，對人體有保健功效。蘋果是深受人們喜愛的水果，位居“功能食品”之首，蘋果中含有大量的蘋果多酚、三萜和植物甾醇、蛋白質、糖分、維生素和微量元素等，其中黃酮類化合物是蘋果中含量最高的一類成分［4］，花青苷就是其中一種黃酮類化合物。普通蘋果的花青苷主要來源于果皮中，果肉中幾乎沒有，而人們處于安全等因素的考慮，吃蘋果時常常將其果皮削去。于是，紅果肉海棠成了一個新穎的研究材料，通過雜交育種得到紅果肉蘋果新品種，將能滿足人們對蘋果營養(yǎng)與保健功能的需求。雜交育種親本的選擇至關重要，不僅親本要攜帶有目的基因或目標性狀，而且要擴大親本間的遺傳差異。傳統(tǒng)育種方法雖然可行，但其受育種家經驗和時空的限制比較明顯。利用AFLP 分子標記技術，從DNA 水平上檢測品種及品系間的遺傳差異，不僅能提高品種鑒定的可靠性，更能為雜交育種的親本選擇提供借鑒。

近幾年分子標記技術如SSR［5］、RAPD［6］、AFLP［7］等已經廣泛被用于蘋果親緣關系及遺傳多樣性方面的研究。Dunemann 等［8］運用RAPD 標記得出矮蘋果(M.pumila)和森林蘋果(M.sylvestris)在栽培蘋果的起源中起作用;王濤等［9］對20 個重要蘋果砧木建立了AFLP 指紋圖譜，分析了砧木間的親緣關系，聚類結果將所試材料聚類為2 個大組，與前人研究的蘋果砧木系譜一致;梁國魯等［10］用AFLP 技術對蘋果屬23 個種共31 個類型分析，驗證了傳統(tǒng)分類的正確性，對難以界定的種進行了分類。本研究以紅果肉海棠為研究對象，加上部分蘋果栽培種以及蘋果屬野生種作為參照，運用AFLP 分子標記的方法對30 個供試材料的親緣關系以及起源進行了探討，為今后分子雜交培育紅果肉蘋果新品種提供理論依據。

1 材料與方法

23 份紅果肉蘋果屬植物樣本和6 份對照樣本(見表1)分別采集于西北農林科技大學種質資源圃和北京植物園。于春天選取幼嫩葉片，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

雜交育種時，子代會遺傳父本或母本身上的某些性狀。因此，親本的選擇非常重要。蘋果屬植物的果實紅色分布類型不同，有的只集中在果核，有的在中果皮外層，有的從表皮到果核全為紅色;紅色深度也從淺紅暈到深紅色不等;果實大小從最小的不足1 cm 的撒氏到5 cm 以上的新疆野蘋果。因此，從果實紅色類型、程度，果實大小等方面對30 份供試材料做出定性測定(表2)。

表1 供試材料

DNA 提取:采用植物基因組DNA 試劑盒提取各試驗材料的基因組DNA。提取的DNA 用1%瓊脂糖凝膠檢測純度，用紫外分光光度計測定DNA 濃度。稀釋DNA 至50 ng/μL，-20 ℃保存。

AFLP 分析:采用Vos et al［11］的方法并稍作改動。反應程序如下:內切酶采用EcoR I 和Mse I 對基因組DNA 進行雙酶切，用T4DNA 連接酶進行連接，酶切連接一步完成，PCR 儀上37 ℃3 h，得到DNA 稀釋10 倍后用于預擴增。預擴增采用Mse I+C/EcoR I+A 引物組合，預擴增程序為:94 ℃30 s，56℃30 s，72 ℃1 min，24 個循環(huán);72 ℃10 min。對預擴增的PCR 產物稀釋10 倍，采用能產生清晰條帶的4 種引物組合對稀釋產物進行選擇性擴增。選擇性擴增程序:94 ℃30 s，65 ℃(每次循環(huán)降低0.7℃)30 s，72 ℃1 min，12 個循環(huán);94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃1 min，24 個循環(huán);72 ℃10 min，-20 ℃保存。

選擇擴增反應結束后在體系中加入5 μL Loading buffer 變性緩沖液混勻后，PCR 儀上95 ℃變性8 min，迅速將PCR 管置于冰上以防止復性，然后冰箱-20 ℃保存。本實驗采用6%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，銀染的方法進行檢測。膠板晾干后在X 線膠片觀察燈下觀察記錄并拍照。

聚類分析:對擴增產物的電泳結果采用“0-1”系統(tǒng)進行統(tǒng)計，觀察電泳圖譜中同一位置上AFLP 條帶的有無，有記為“1”，無記為“0”，形成“0/1”矩陣圖輸入計算機。采用多變量分析系統(tǒng)(NTSYS2pc，2.10 版)軟件中的SM(simple matching)相似性系數法計算遺傳相似系數，然后根據相似系數用非加權組平均法(UPGMA)進行聚類分析，并繪制成樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 AFLP 擴增片段的多態(tài)性

從64 對引物組合中篩選出擴增條帶豐富、分辨能力強的4 對引物組合，用這4 對引物對30 份樣品進行擴增，共擴增出94 條有效條帶，其中多態(tài)性條帶92 條，多態(tài)位點百分率為97.9%(表2)?？梢娫囼灅颖揪哂休^高的遺傳多樣性，所有的樣本都可以與其他樣本區(qū)分開。圖1是引物M-CTC/E-AGC對30 份樣本的擴增結果。

表2 4 對AFLP 選擇性擴增引物產生的條帶多態(tài)性

2.2 遺傳多樣性聚類分析

從圖2可看出，30 個植物樣品之間的相似系數為0.63～0.95。當相似系數為0.65 時，樣品可劃分為4 組，A 組中包括6 種歐美海棠高原之火、路易莎、秀場、道格、鉆石、紅巴倫以及1 種澳大利亞育種的粉女士紅果皮蘋果。粉女士是澳大利亞用蘋果‘Lady Williams’和‘Golden Delicious’雜交育種得出的優(yōu)良品種。而‘Lady Williams’被認為是由歐洲野蘋果(Malus sylvestris)和蘋果(M.domestica)授粉而產生的。粉女士與其他六種歐美海棠聚在同一組，這與以上推測結果相一致，說明AFLP 分子標記技術能在分子生物學層面上為物種的起源提供有力證據。

B 組中包括霍巴、麗絲、雷蒙、瑪瑙、王族、粉芽、紅麗、火焰、完美紫葉、印第安夏天等紅果肉雜交種以及野生種新疆紅肉蘋果、花紅和山荊子。其中，已知霍巴海棠是由新疆紅肉蘋果和山荊子雜交選育得到的第一個玫紅系列海棠。雷蒙海棠為新疆紅肉蘋果和深紅海棠的雜交后代，麗絲海棠為雷蒙和三葉海棠的雜交后代，王族、紅麗、火焰均為玫紅海棠系列天然雜交的后代。這一組是新疆野蘋果與山荊子雜交得到的玫紅系列的后代。它們的果實紅色分布(整個果都是紅色)和紅色程度(大部分都為粉紅)基本相同(見表3)。

表3 材料性狀測定

C 組包括印第安魔力、朱砂、三葉海棠、珠眉海棠、絢麗、凱爾斯、撒氏，其中絢麗、凱爾斯為玫紅海棠系列品種。撒氏海棠最早在日本園林栽培中出現，形態(tài)特征與三葉海棠近似，它與原產中國東部、日本及朝鮮的三葉海棠關系密切，AFLP 聚類結果顯示，二者的親緣關系與之相吻合。珠眉海棠為三葉海棠與近源種雜交的后代，親本未知的印第安魔力、朱砂聚在此組，由此可以推測它們與三葉海棠的親緣關系比較近，可對將來找到它們的親本及相關育種有幫助。

D 組包括新疆野蘋果、富士蘋果、嘎啦蘋果。富士是日本以國光為母本，元帥為父本雜交選育出的蘋果優(yōu)良品種。它與嘎啦((元帥×橘蘋)×金冠)和新疆野蘋果聚在一起，它們都是果實較大的類型(見表3)，進一步印證了新疆野蘋果是現代栽培蘋果的祖先的論斷。

圖1 引物M-CTC/E-AGC 組合對供試樣本的AFLP 擴增圖譜

圖2 30 個供試樣本AFLP 分析聚類樹狀圖

3 結論與討論

本研究中親緣關系較近的品種緊密的聚在一起，而且具有相同親本起源的品種相似系數極高。如市場上常見的嘎拉((元帥×橘蘋)×金冠)和富士(國光×元帥)，他們都有相同的親本“元帥”，他們的相似性系數為0.927 5，與劉鳳之［12］(2007)用SSR 分子標記得出的聚類分析結果(相似度系數為0.890 3)一致。“麗絲”(M.‘Liset’)是雷蒙和三葉海棠的雜交種，它既有雷蒙的某些特征，又和三葉海棠具有一定的相似性。但在本次聚類中，麗絲與其親本之一雷蒙‘Lemoinei’聚在一起，他們的相似系數為0.768 1，而與另外一個親本三葉海棠相對較遠，相似系數為0.681 2，這與趙天田等［13］人在研究海棠單株親本鑒定時得出的一些雜交種在聚類時有向母本聚類的趨勢的結論相一致。

雜交育種是一種重要植物育種方式，親本遺傳距離的遠近對雜交育種的結果影響很大［14］，如果兩個親本遺傳距離過大，可能會因為種間不親和性而導致雜交不育現象發(fā)生，選擇親緣關系相近的親本作為育種材料能大大提高雜交育種成功率。AFLP 標記從分子水平對植物進行聚類，對植物親緣關系的分析比較準確可靠，可以在判斷親本遺傳距離時提供幫助，為雜交育種親本選擇提供依據。例如，山荊子作為一種良好的砧木，具有根系發(fā)達，抗病性好等優(yōu)點，若想培育一種具有良好抗性的彩色葉紅果肉海棠新品種，可參考圖2的分子標記聚類分析結果，選擇與山荊子遺傳相似性高的彩色葉紅果肉‘王族’海棠作為親本與山荊子進行雜交，提高其育種成功率。

通常認為“絢麗”海棠是霍巴海棠天然雜交的結果，但是在本聚類中，絢麗卻沒有和其母本霍巴海棠聚在一組，這種現象可能是因為其與未知的父本的親緣關系近似，它和印第安魔力、朱砂、三葉海棠、珠眉海棠、凱爾斯、撒氏一同被聚類在C 組，所以，絢麗海棠的父本可能與C 組中基因近似。當然，另外一種解釋是絢麗不是霍巴海棠天然雜交的結實后代，因此，需要進一步的研究來闡明絢麗海棠的起源。另外，王族和紅巴倫由于樹形近似，枝條開展角度狹窄，枝葉繁密，都具有深紫色葉和光滑枝條，果肉的顏色也都是深紅色。雖然他們常被人們混淆，但是用分子標記可以很好地將二者區(qū)分開，因此，AFLP 分子標記可以為形態(tài)易混淆種或品種的辨認提供可靠依據。

新疆的野生蘋果在世界蘋果屬植物的起源中起著極其重要的作用。Ponomarenko［15］及Janick［16］認為中亞地區(qū)(包括哈薩克斯坦、烏茲別克斯坦、中國新疆地區(qū)等)是栽培蘋果的起源中心，并提出新疆野蘋果是栽培蘋果祖先。俞德浚［17］將新疆野蘋果(Malus sieversii)列入真蘋果組(Eumalus Zabel)的蘋果系(Pumilae Rehd.)，首次賦予新疆野蘋果在蘋果屬中的分類地位。在本實驗中，新疆野蘋果和栽培蘋果富士、嘎啦共同聚在D 組，印證了新疆野蘋果是栽培蘋果祖先這一論斷。本研究中的紅果肉蘋果的親本在先前都有記載［18-19］。根據記載，幾乎所有紅果肉海棠變種都可以追溯至新疆紅肉野蘋果(Malussieversiif.neidzwetzkyana (Dieck)Langenf)。本次聚類分析，許多紅果肉海棠都和新疆紅肉蘋果聚為一組，如霍巴、雷蒙和麗絲等，這驗證了新疆紅肉蘋果是現代紅果肉海棠起源的觀點。新疆紅肉蘋果紅色芽，開單花紅色，約4～5 cm，果實紫紅色，果肉紅色，果徑約5～6 cm，發(fā)現于中國邊界的天山，新疆紅肉蘋果的無性繁殖苗給現代海棠帶來了的巨大變化，它的嫩葉、芽、花、果(包括果肉)、枝干均為紅色，因為它獨特的顏色，被大量用于雜交。從單獨的樣本來看，雖然本次聚類中新疆紅肉蘋果與新疆野蘋果未聚在同一組，有一定差異，但大部分品種的遺傳相似性系數都在0.68 以上，總體上比較近，因此以紅果肉海棠與當前的栽培蘋果品種為親本進行雜交育種在克服雜交不親和性方面具有明顯的優(yōu)勢。

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