趙銀娟

(南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇省有害生物入侵預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南京林業(yè)大學(xué))，南京，210037)

嚴(yán)芳 吳小芹

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)) (南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇省有害生物入侵預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南京林業(yè)大學(xué)))

責(zé)任編輯:程 紅。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)對多種植物病害具有較好的生防效應(yīng)，因而被廣泛關(guān)注［1-5］。同時(shí)該菌也是作為革蘭氏陽性菌和芽孢桿菌的良好模式菌株。目前對其模式菌株的研究相當(dāng)深入，尤其是關(guān)于芽孢的生成機(jī)理、生物膜的形成等［6-10］。本研究前期在1 株應(yīng)用良好的生防菌蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)的轉(zhuǎn)座子突變庫中，篩選到與芽孢形成、生物膜以及對外界壓力變化有極大關(guān)聯(lián)的相關(guān)基因，網(wǎng)上比對結(jié)果顯示該基因與一類重要的ATP 依賴的水解蛋白酶ClpQY 序列同源性較高。ClpQY早期被命名為HslVU，被認(rèn)為是熱激作用相關(guān)蛋白。目前對其研究主要集中在大腸桿菌(Escherichia coli)中，研究表明其控制了轉(zhuǎn)錄因子sigma32 的水平，而sigma32 直接調(diào)控轉(zhuǎn)錄熱激相關(guān)蛋白的RNA 聚合酶［11］。此外，ClpQY 也調(diào)控了大腸桿菌細(xì)胞分裂的抑制蛋白SulA，調(diào)控了在環(huán)境壓力下的細(xì)胞周期［12］。而該蛋白在枯草芽孢桿菌中目前還未見有相關(guān)報(bào)導(dǎo)。

為了驗(yàn)證枯草芽孢桿菌中ClpQY 基因的功能，本研究采用同源重組的方法，在基因組全序列清楚的枯草芽孢桿菌模式菌株NCIB 3610 中，構(gòu)建ClpQY 基因的無痕缺失突變菌株，以進(jìn)一步弄清ClpQY 在枯草芽孢桿菌中的功能，了解枯草芽孢桿菌的生防機(jī)理，同時(shí)，為其他芽孢桿菌的研究提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

枯草芽孢桿菌3610、枯草芽孢桿菌PY79、大腸桿菌DH5α、質(zhì)粒pMAD(mlsr)，均由江蘇省有害生物入侵預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

T4DNA 連接酶、Taq DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶、1 kb DNA Ladder 林可霉素(mls)等購于NEB 公司;PCR 引物由IDT 生物技術(shù)公司合成;質(zhì)粒小樣快速提取試劑盒、DNA 片段純化回收試劑盒、基因組DNA 提取試劑盒購于QIAGEN 生物公司，蛋白胨、酵母粉等為Oxoid 公司產(chǎn)品。

大腸桿菌和枯草芽孢桿菌等所用培養(yǎng)基為常規(guī)LB 培養(yǎng)基，37 ℃或30 ℃培養(yǎng);林可霉素在LB 培養(yǎng)基中的終質(zhì)量濃度為100 mg·L-1。枯草芽孢桿菌產(chǎn)孢試驗(yàn)采用DSM 培養(yǎng)基。

1.2 枯草芽孢桿菌基因組DNA 的提取

參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中革蘭氏陽性菌的基因組DNA 提取步驟進(jìn)行［13］27。

1.3 ClpQY 基因左右臂序列的擴(kuò)增

根據(jù)枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株B.subtilis 3610 全基因組序列(subtiList Web Server)用Primer 5.0 設(shè)計(jì)引物并引入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)(表1)。以subtiList Web Server 上提供的枯草芽孢桿菌3610 全基因組序列顯示，ClpQY 基因全長1 963 bp。根據(jù)ClpQY 基因及上下游序列設(shè)計(jì)2 對寡核苷酸引物ClpQY-up-F，ClpQY-up-R;ClpQY-down-F，ClpQY-down-R，引物上分別添加酶切位點(diǎn)(表1下劃線所示)。以提取的枯草芽孢桿菌3610 菌株基因組為模板，PCR擴(kuò)增出ClpQY 基因兩側(cè)分別為840 bp 和983 bp 的同源臂序列，兩側(cè)同源臂間缺失1 927 bp 的ClpQY閱讀框序列。上游同源臂擴(kuò)增條件，94 ℃1 min，94℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min;下游同源臂擴(kuò)增條件，94 ℃1 min，94 ℃1 min，51 ℃1 min，72 ℃1 min，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min?？莶菅挎邨U菌基因組的提取，大腸桿菌質(zhì)粒提取，DNA 片段的回收、酶切、純化、與載體的連接轉(zhuǎn)化等操作，參照相關(guān)試劑盒的說明書;DNA 測序委托IDT 生物技術(shù)公司。

表1 引物序列及引入的酶切位點(diǎn)

1.4 ClpQY 基因左右臂的克隆

將純化的PCR 產(chǎn)物與質(zhì)粒pMAD 進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，在含有mlsr(100 mg·L-1)LB 平板上37 ℃培養(yǎng)16 h，隨機(jī)挑取陽性菌落進(jìn)行菌落PCR，并提取質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證，得到重組質(zhì)粒pMAD-up、pMAD-down，并測序上網(wǎng)比對驗(yàn)證。用Bgl Ⅱ和EcoR Ⅰ雙酶切重組質(zhì)粒pMAD-up，EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切ClpQY 下游同源臂PCR 產(chǎn)物，并將酶切過的質(zhì)粒和PCR 產(chǎn)物用T4DNA 酶連接起來，同時(shí)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得pMAD-up-down 重組質(zhì)粒，并測序上網(wǎng)比對驗(yàn)證。

1.5 缺失基因ClpQY(△ClpQY)菌株的構(gòu)建

將此pMAD-up-down 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞枯草芽孢桿菌PY79 菌株，在mls 抗性平板上30 ℃培養(yǎng)過夜，挑取陽性克隆，并用引物ClpQY-up-F 和ClpQY-down-R 進(jìn)行菌落PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證，選取PCR 產(chǎn)物有1.8 kb 和3.7 kb 左右的2 條帶的陽性菌落，提取其基因組，用相同的方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞枯草芽孢桿菌3610 菌株，稀釋涂布LB 平板后，于30℃過夜培養(yǎng)，待長出菌落后，用牙簽挑取單菌落，影印接種至LB 平板和含mls 的LB 平板上，30 ℃過夜培養(yǎng)，挑取mlsrLB 平板上沒有而LB 平板上生長的單菌落，同樣用引物ClpQY-up-F 和ClpQY-down-R PCR 驗(yàn)證，目標(biāo)基因已被敲除。

1.6 轉(zhuǎn)化

大腸桿菌轉(zhuǎn)化和枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化均采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法［13］96。

1.7 生物膜形成的觀察

不同菌株在LB 中培養(yǎng)至對數(shù)期，取10 μL 相同濃度的菌液，接種至12 孔板中，每孔中加入3 mL LBGM 培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中，30 ℃靜置培養(yǎng)一段時(shí)間后取出觀察。

1.8 菌體濃度測定

不同培養(yǎng)時(shí)間，取1 mL 待測液(濃度過高時(shí)，10倍稀釋)，搖勻，以空白培養(yǎng)液為參比，用752 型分光光度計(jì)測定600 nm 處的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 ClpQY 基因左右臂的克隆與序列

ClpQY 基因全長1 963 bp，為了用同源重組的方法將基因ClpQY 完全敲除掉，設(shè)計(jì)左臂中攜帶ClpQY 基因中的18 bp，右臂中也攜帶下游的18 bp。用引物對ClpQY-up-F/ClpQY-up-R 擴(kuò)增枯草芽孢桿菌3610 菌株的左臂序列，ClpQY-down-F/ClpQYdown-R 擴(kuò)增枯草芽孢桿菌3610 菌株的右臂序列，分別獲得840 bp 和983 bp 的片段，將獲得的片段分別克隆至pMAD 質(zhì)粒中，篩選陽性重組質(zhì)粒，經(jīng)測序比對，與枯草芽孢桿菌3610 基因組序列同源性達(dá)100%，可用于同源重組時(shí)的左右臂序列。

2.2 重組質(zhì)粒pMAD－up－down::mls 的構(gòu)建及鑒定

將左臂質(zhì)粒pMAD-up 用限制性內(nèi)切酶BglⅡ和EcoRⅠ酶切，右臂PCR 產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后，再用T4DNA 連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMAD-up-down::mls，并用引物ClpQY-up-F/ClpQY-down-R 進(jìn)行PCR 鑒定，獲得1.8 kb 左右的條帶，圖1中的C 列，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 ClpQY 基因缺失突變株的構(gòu)建

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pMAD-up-down::mls 轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞枯草芽孢桿菌菌株P(guān)Y79，mlsrLB平板上培養(yǎng)過夜，獲得陽性克隆，用引物ClpQY-up-F/ClpQY-down-R 進(jìn)行PCR 鑒定，同源重組交換后，應(yīng)該會在基因組中擴(kuò)增出1.8 kb 和3.7 kb 左右的2 條帶。結(jié)果顯示，在挑取的9 個(gè)陽性克隆子中，有4 個(gè)出現(xiàn)了1.8 kb 和3.7 kb 左右的兩條帶(1、5、7、8 號)，而3610 和重組質(zhì)粒pMAD-up-down 分別擴(kuò)增出3.7 kb 和1.8 kb 左右的條帶(圖1)，這說明這4 個(gè)克隆已完成了左右臂與PY79 基因組的同源重組，即PY79 的LOOP IN。

2.4 ClpQY 缺失突變株的鑒定

提取LOOP IN 的PY79 全基因組，用同樣的方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞枯草芽孢桿菌菌株3610，稀釋涂布于LB 平板上，待長出單克隆后，用牙簽影印涂布至LB 平板和mlsrLB 平板上，同源重組后，ClpQY 將被完全敲除，此時(shí)，突變株將只能在LB 平板上生長(圖2A)，而不能在mlsrLB 平板上生長(圖2B)。相對應(yīng)地挑取LB 平板上的菌落，并提取基因組，同樣利用引物ClpQY-up-F/ClpQY-down-R 來進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證，只出現(xiàn)1.8 kb 左右的條帶，而沒有3.7 kb 左右條帶的克隆即為ClpQY 基因敲除的缺失菌株，挑取的21 個(gè)克隆中僅2、11、16 號為陽性，其余為假陽性(野生型)(圖3)。

圖1 菌落PCR 檢測pMAD-up-down 與PY79 同源重組結(jié)果

圖2 平板影印法檢測枯草芽孢桿菌3610 ClpQY 基因敲除克隆

圖3 菌落PCR 鑒定枯草芽孢桿菌3610 ClpQY 基因敲除結(jié)果

2.5 ClpQY 基因缺陷對枯草芽孢桿菌生物膜形成的影響

從圖4可以看出，相比較于野生型菌株3610，在其剛剛形成生物膜的時(shí)候，ClpQY 基因缺失后的枯草芽孢桿菌3610 已具有明顯的生物膜特征，而過表達(dá)ClpQY 的3610 則比野生型菌株弱，而在缺陷ClpQY 基因菌株中再次轉(zhuǎn)入ClpQY 質(zhì)粒后，發(fā)現(xiàn)生物膜的形成介于野生型和缺失菌株之間，由此可推測，ClpQY 對形成生物膜的相關(guān)基因具有調(diào)控作用。

2.6 高溫脅迫對ClpQY 基因缺失突變株生長的影響

從圖5可以看出，在37 ℃下，枯草芽孢桿菌3610 和ClpQY 突變株的生長差異不大;在3610 和缺失突變株中過表達(dá)ClpQY(ClpQY)的菌株，生長也沒有很大變化，而在53 ℃高溫壓力下，4 菌株生物量在2～4 h 持續(xù)增長，而4 h 后，枯草芽孢桿菌3610菌株的生長受到了抑制，尤其是在3610 中過表達(dá)ClpQY 的菌株，生物量增加更少，而ClpQY 缺失菌株則繼續(xù)維持一定的生長，生物量持續(xù)增加，至6 h 達(dá)到最高;在缺失菌株中轉(zhuǎn)化入ClpQY 的菌株(△ClpQY-ClpQY)則介于兩者之間，6 h 后，野生型3610 菌株及帶有ClpQY 質(zhì)粒的另外2 株菌和ClpQY缺失菌株生物量均開始下降。然而，ClpQY 缺失菌株的生物量始終高于其他3 株，這說明，ClpQY 的缺失對枯草芽孢桿菌在高溫下的生長要高于野生型菌株，表明它的存在不是高溫生長所必需的，相反，它很有可能降解了穩(wěn)定細(xì)胞在高溫下生存的一些因子，從而表現(xiàn)出在缺失菌株在高溫脅迫中的延遲性。

圖4 ClpQY 基因?qū)莶菅挎邨U菌生物膜形成的影響

圖5 ClpQY 基因?qū)莶菅挎邨U菌在高溫下生長的影響

3 討論

枯草芽孢桿菌作為生防菌的應(yīng)用研究在國內(nèi)較多，而對其機(jī)理的探討相對較少。從國外對枯草芽孢桿菌生防機(jī)理的研究結(jié)果來看，該菌防治植物病害的主要作用方式為:拮抗物質(zhì)的生成［14-18］、誘導(dǎo)寄主抗性［19］、競爭作用［20-21］等。如產(chǎn)生枯草菌素拮抗物質(zhì)，或形成生物膜提高生防菌定殖能力，抵御不良環(huán)境，阻止病原菌的侵入等。本研究前期在研究1 株生防菌蠟狀芽孢桿菌的生防機(jī)理時(shí)，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)座突變庫中與芽孢和生物膜形成等相關(guān)的序列，比對結(jié)果顯示其與ClpQY 同源性最高。本研究利用同源重組的方法獲得了遺傳背景相對清楚的枯草芽孢桿菌的ClpQY 缺失突變株，對其產(chǎn)孢和高溫下生長狀況作了探討，這將為其他芽孢桿菌的研究提供很好的借鑒。

ClpQY 是一類重要的ATP 依賴的水解蛋白酶，在真核生物瘧原蟲中，前人發(fā)現(xiàn)其對瘧原蟲的生長有極大的影響，敲除該基因可引起瘧原蟲的程序性死亡［22-23］。而在對原核生物的研究中，主要集中在大腸桿菌。Kanemori et al.［12］研究發(fā)現(xiàn)，ClpQY 可以協(xié)同其他蛋白酶，如ClpXP、ClpAP、FtsH 等，在高溫脅迫或其他脅迫時(shí)，降解非正常蛋白，同時(shí)，對維持細(xì)胞穩(wěn)定性的sigma32 因子等轉(zhuǎn)錄因子的水平及其合成進(jìn)行調(diào)節(jié)。體外試驗(yàn)也顯示，ClpQY 在高溫下對sigma32 的降解速度比正常生長溫度快15 倍［24］。在本研究中，枯草芽孢桿菌的ClpQY 缺失菌株在高溫生長時(shí)，比野生型3610 菌株的耐受性更高，這說明，ClpQY 并不是高溫壓力下必需的基因，它的缺失不會影響其生長;反之，它很可能像在大腸桿菌中一樣，程序性水解了對維持細(xì)胞穩(wěn)定性有重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，如此，在高溫脅迫下，缺失菌株反而表現(xiàn)出比野生型菌株更高的耐受性而產(chǎn)生更多的生物量。因此，下一步有必要對ClpQY 在枯草芽孢桿菌中的調(diào)控通路和作用方式作進(jìn)一步的研究。

ClpQY 對枯草芽孢桿菌生物膜的形成同樣存在著類似的調(diào)節(jié)過程，由于本研究中對ClpQY 缺失菌株的產(chǎn)孢和對照相比，并沒有明顯地變化(結(jié)果未顯示)，而生物膜的形成卻具有提前的效應(yīng)，當(dāng)在3610 中過表達(dá)ClpQY 時(shí)，生物膜的形成要晚于野生型和缺失菌株，而在缺失菌株中轉(zhuǎn)入ClpQY 時(shí)，則中和了此效應(yīng)，由此說明，ClpQY 對生物膜的形成確實(shí)具有調(diào)控作用。Vlamakis et al.［25］研究表明，Spo0A在生物膜的形成過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，其磷酸化水平?jīng)Q定了生物膜或芽孢的形成，因此，可推測ClpQY 的下游很有可能是Spo0A，這為更進(jìn)一步深入研究ClpQY 的調(diào)控通路打下了基礎(chǔ)。

本研究中，能夠高效地構(gòu)建ClpQY 缺失菌株，是利用馴化的高感受態(tài)枯草芽孢桿菌PY79 菌株作為過渡，從而增加了重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率，同時(shí)，LOOP IN 的PY79 基因組和3610 基因組間的重組率也由于同源片段的增加而使得重組率大大提高。因此，該方法能夠在短時(shí)間之內(nèi)獲得敲除目的基因的缺失菌株，且采用這種方法獲取的缺失菌株是完全敲除了目的基因而不帶入抗性基因的菌株。因此，避免了抗性基因?qū)甑挠绊?，也避免了由于敲除不徹底而帶來的對基因功能的影響，以及對下游基因表達(dá)的極性效應(yīng)。目前，該方法的應(yīng)用在國內(nèi)還不常見。因此，采用高感受態(tài)枯草芽孢桿菌PY79 作為過渡，采用LOOP IN 和LOOP OUT 的方法，對于成功高效地構(gòu)建枯草芽孢桿菌缺失菌株具有很好的借鑒作用。

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