鄒沐平, 董 棟 王懷玲 王巧利 蒲含林, 王一飛

(1. 暨南大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生物醫(yī)藥研究開發(fā)基地, 廣東 廣州 510632; 2. 暨南大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生物工程研究所, 廣東 廣州 510632)

瓊枝麒麟菜多糖抗呼吸道病毒活性研究

鄒沐平1,2, 董 棟1, 王懷玲1, 王巧利1, 蒲含林2, 王一飛1

(1. 暨南大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生物醫(yī)藥研究開發(fā)基地, 廣東 廣州 510632; 2. 暨南大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生物工程研究所, 廣東 廣州 510632)

為了評價瓊枝麒麟菜多糖(EGP)包括粗提物(CEGP)及大于500 kDa多糖組分(LEGP)抗呼吸道相關(guān)病毒活性。采用Reed-muench法計(jì)算流感病毒H1N1、H3N2和H5N3, 柯薩奇病毒CVB3及呼吸道合胞病毒RSV-long株滴度; 采用觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)法, 確定CEGP和LEGP對犬腎細(xì)胞(MDCK),人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)和人喉癌上皮細(xì)胞(HEp-2)的最大無毒濃度; 通過細(xì)胞病變觀察法(CPE)及四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)測定CEGP和LEGP抑制各病毒產(chǎn)生細(xì)胞病變的作用。結(jié)果表明: CEGP和LEGP對5種常見的呼吸道病毒H1N1、H3N2和H5N3, CVB3和RSV都有抑制作用, CVB3和RSV對CEGP和LEGP更敏感; CEGP和LEGP有抗多種呼吸道病毒作用, 為抗呼吸道病毒新藥的研發(fā)提供理論依據(jù)。

瓊枝麒麟菜多糖; 抗病毒; 呼吸道病毒

呼吸道病毒是一類能侵犯呼吸道或以呼吸道為侵入門戶而引起呼吸道及呼吸道外組織器官病變的病毒[1]。呼吸道病毒包括流感病毒(H1N1, H3N2, H5N3等)、呼吸道合胞病毒(RSV)和科薩奇病毒(CVB3)等。流感病毒傳染性極強(qiáng)且極易變異, 危害性大, 難以控制[2], 目前廣泛使用的抗流感病毒的西藥具有一定的毒副作用, 并可引起流感病毒變異, 或產(chǎn)生不同程度的耐藥性[3]?？滤_奇病毒CVB3是非常嚴(yán)重的致病病原[4-5], 目前尚無有效藥物[6]。呼吸道合胞病毒RSV可引起嬰幼兒嚴(yán)重呼吸道感染, 目前只有病毒唑和RSV免疫球蛋白2種藥物。但病毒唑不良反應(yīng)較嚴(yán)重, RSV免疫球蛋白治療費(fèi)用很高。綜上, 呼吸道病毒對人類危害大, 人類尚無法阻止這些病毒感染或進(jìn)行有效治療, 因此, 開發(fā)研制藥效可靠, 毒副作用小的新藥, 仍然是國際新藥研發(fā)的重要任務(wù)。

近年來對海洋資源的開發(fā)成為熱點(diǎn), 目前國內(nèi)外對海洋生物活性物質(zhì)的研究都取得一定進(jìn)展。許多從海洋生物中提取的天然產(chǎn)物具有抗腫瘤, 抗凝血, 抗病毒[7-8]等的生物活性。從海洋生物中提取的多糖, 尤其是從海藻中提取的硫酸酯多糖, 不僅能提高機(jī)體免疫力, 而且具有廣泛的抗病毒作用[9]。

瓊枝麒麟菜(Eucheuma gelatinae)屬于紅藻門,麒麟菜屬, 在我國海南島有大規(guī)模的人工養(yǎng)殖, 資源十分豐富[10]。麒麟菜中含有豐富的多糖, 約占藻體干重的60%。迄今為止, 人們對瓊枝麒麟菜在抗病毒等生物活性方面的研究較少。本文對瓊枝麒麟菜多糖粗提物(CEGP)及大于500 kDa多糖組分(LEGP)抗呼吸道相關(guān)病毒活性進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 病毒

流感病毒H1N1、H3N2和H5N3, 呼吸道合胞病毒RSV-long株和柯薩奇病毒CVB3均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 細(xì)胞

犬腎細(xì)胞(MDCK), 人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)和人喉癌上皮細(xì)胞(HEp-2), 均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 藥物

參考王懷玲等[11]多糖提取工藝, 通過水提醇沉法得到瓊脂麒麟菜粗多糖(CEGP), 并通過膜分離技術(shù)從瓊枝麒麟菜粗多糖中分離出大于 500 kDa的多糖組分(LEGP)。所有樣品均沒有檢測出核酸及蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。

1.1.4 試劑與器材

胎牛血清, 杭州四季青生物材料工程有限公司;二甲基亞砜, 廣州化學(xué)試劑廠; DMEM培養(yǎng)基, Gibco公司; MEM 培養(yǎng)基, Gibco公司; 培養(yǎng)箱, 日本SANYO公司; 96孔培養(yǎng)板, 美國 CORNING公司;倒置顯微鏡, 德國 Leica公司; 超凈工作臺, 蘇州凈化設(shè)備公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 病毒毒力測定[12]

選用MDCK、HeLa和HEp-2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。接種1.5×105個/mL細(xì)胞于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板, 在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20 h, 待細(xì)胞生長成單層后, 吸棄培養(yǎng)基, 用PBS洗滌3次, 加入用維持液按10倍遞減稀釋的病毒毒液100 μL/孔, 設(shè)8個復(fù)孔, 同時設(shè)正常細(xì)胞對照。37℃, 5% CO2溫箱中培養(yǎng)3 d, 在倒置顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)變化(CPE), 細(xì)胞無病變?yōu)楱C, 病變 0～25%為+, 病變 25%～50%為++, 病變50%～75%為+++, 病變75%～100%為++++。根據(jù)觀察結(jié)果用K?rber 公式計(jì)算TCID50。

1.2.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

選用MDCK、HeLa和HEp-2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。對CEGP和LEGP的細(xì)胞毒性進(jìn)行測定, 計(jì)算最大無毒劑量(TC0)。細(xì)胞長成單層后, 吸棄培養(yǎng)液, 分別加入維持液按2倍比稀釋成不同濃度的藥液, 每孔100 μL,各設(shè)6個復(fù)孔, 同時設(shè)正常細(xì)胞對照, 其間置倒置顯微鏡下觀察, 采用 CPE法[10], 觀察藥物的最大無毒濃度TC0。

1.2.3 抗呼吸道相關(guān)病毒活性[13]

選用MDCK、HeLa和HEp-2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。在96孔培養(yǎng)板中接種細(xì)胞密度為1.5×105個/mL, 每孔100 μL, 37℃, 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20 h, 待其生長為單層細(xì)胞, 棄去培養(yǎng)液, 用PBS洗3次, 將不同稀釋度的藥物(在無毒濃度范圍內(nèi))和病毒稀釋液(100TCID50)各 50 μL直接加到單層細(xì)胞上, 先加樣品液, 再加病毒液。每個濃度設(shè)3個復(fù)孔, 100 μL/孔,同時設(shè)病毒對照組、正常細(xì)胞對照組, 置于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～72 h, 其間置倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變(CPE)的情況。待病毒對照組的細(xì)胞病變達(dá)到 75%以上, 而對照組細(xì)胞正常時, 觀察并記錄各孔的CPE, 并做MTT定量活細(xì)胞數(shù)計(jì)算病毒抑制率。

病毒抑制率=(藥物組吸光度–病毒組吸光度)/(對照組吸光度–病毒組吸光度)×100%。

根據(jù)病毒抑制率計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)和藥物的治療指數(shù)TI= TC50/ IC50。

1.2.4 麒麟菜多糖樣品抗病毒機(jī)理初探

LEGP雖然是 CEGP進(jìn)一步精制所得, 但是抗病毒活性與 CEGP相似, 且沒有明顯提高, 為以后產(chǎn)業(yè)化工藝成本考慮, 選用CEGP進(jìn)行機(jī)制研究。根據(jù)1.2.3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 選取CEGP抗病毒活性較好的兩株病毒進(jìn)行抗病毒機(jī)理的初步探索。按不同給藥途徑設(shè)置三組實(shí)驗(yàn): a. 感染病毒前加藥法。將CEGP用維持液對倍稀釋后加入長成單層的Hela細(xì)胞, 每孔 50 μL。37℃吸附兩小時后加入 50 μL CVB3病毒懸液。b. 直接滅活法。將CEGP用維持液對倍稀釋后與相同體積的 CVB3病毒懸液混合,在37℃孵育2 h后加入單層Hela細(xì)胞。c. 感染病毒后加藥法。接種50 μL病毒懸液于單層細(xì)胞中, 在37℃吸附1 h后加入用維持液對倍稀釋的CEGP溶液[11]。所有96孔培養(yǎng)板均置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng), CPE觀察, 待病毒對照孔達(dá)到 75%以上病變程度時, 用 MTT法定量活細(xì)胞數(shù)計(jì)算病毒抑制率, 方法如1.2.3。

2 結(jié)果

2.1 病毒滴度測定

通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況, Reedmuench方法計(jì)算各毒株TCID50(表1)。以100TCID50的濃度進(jìn)行抗病毒實(shí)驗(yàn)。

表1 實(shí)驗(yàn)所用各毒株滴度Tab.1 Virus titer used in the experiment

2.2 CEGP和LEGP對各細(xì)胞株的細(xì)胞毒性測定

以正常細(xì)胞無死亡、不引起細(xì)胞病變的最高藥物稀釋濃度作為對各株細(xì)胞的最大無毒濃度 TC0, CPE觀察結(jié)果見表2。

CPE觀察結(jié)果得, CEGP和LEGP在實(shí)驗(yàn)所用濃度(≤500 μg/mL)范圍對MDCK, HeLa, HEp-2細(xì)胞均無毒。

表2 CEGP和LEGP的細(xì)胞毒性Tab.2 Cytotoxicity of CEGP and LEGP

2.3 CEGP和LEGP對呼吸道相關(guān)病毒的作用

倒置顯微鏡下觀察, 流感病毒感染使細(xì)胞出現(xiàn)破碎、皺縮成團(tuán)等病變特征(如圖 1b); 科薩奇病毒CVB3感染使細(xì)胞皺縮、變圓死亡(如圖2b); 呼吸道合胞病毒 RSV感染導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)典型的合胞體(如圖3b)。CEGP及LEGP在實(shí)驗(yàn)所用濃度(≤500 μg/mL),均能不同程度地抑制各株病毒感染所致的細(xì)胞病變(如表3所示), 且CEGP和LEGP的作用相似。病毒RSV和CVB3均比三株流感病毒對CEGP 和LEGP更敏感, 最低濃度31.25 μg/mL的CEGP 和LEGP可100%抑制病毒 RSV引起的細(xì)胞病變, 而最低濃度62.5 μg/mL 的 CEGP和 LEGP可 100%抑制病毒CVB3引起的細(xì)胞病變?？共《净钚约爸委熤笖?shù)結(jié)果(表 4)顯示 CEGP對科薩奇病毒的半數(shù)治療指數(shù)為0.371 μg/mL, LEGP對科薩奇病毒的半數(shù)治療指數(shù)為0.263 μg/mL, 治療指數(shù)分別是大于1347及1901。

圖1 顯微鏡下MDCK細(xì)胞形態(tài): 正常細(xì)胞(a), 流感病毒感染后(b)和流感病毒 + CEGP(c)Fig.1 MDCK cells under the microscope: normal cells (a), cells infected with the influenza virus (b), cells infected with the virus but treated with CEGP (c)

圖2 顯微鏡下HeLa細(xì)胞形態(tài): 正常細(xì)胞(a), 感染后(b)和+CEGP(c)Fig.2 Hela cells under the microscope: normal cells (a), cells infected with CVB3 (b), cells infected with the virus but treated with CEGP (c)

圖3 顯微鏡下HEp-2細(xì)胞形態(tài): 正常細(xì)胞(a), 感染后(b)和+CEGP(c)Fig.3 HEp-2 cells under the microscope: normal cells (a), cells infected with RSV (b), cells infected with the virus but treated with CEGP (c)

表3 CEGP和LEGP抗呼吸道相關(guān)病毒活性(CPE)Tab.3 Anti-respirovirus activity of CEGP and LEGP (CPE)

表4 CEGP和LEGP的抗病毒活性及治療指數(shù)Tab.4 Antiviral activity and the therapeutic index of CEGP and LEGP

待病毒對照孔病變達(dá)到 75%以上而且病變不再隨時間增加而變化時, 用MTT法檢測各孔中細(xì)胞存活率。結(jié)果如圖4和圖5, CEGP和LEGP的抗病毒活性都呈濃度依賴性, 且高濃度對病毒抑制率更高。

圖4 CEGP對實(shí)驗(yàn)中各株病毒抑制作用的效量關(guān)系Fig.4 Inhibition effect of the virus (CEGP)

2.4 麒麟菜多糖樣品抗病毒機(jī)理初探

根據(jù)2.3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 選取抗病毒活性較好的兩株病毒RSV和CVB3進(jìn)行抗病毒機(jī)理的初步研究。不同給藥途徑下CEGP的抗病毒活性見圖6及圖7。

由圖 6和圖 7知, 不同給藥途徑下 CEGP對CVB3和 RSV兩種病毒的抑制效果一致, 都是先加藥后感染病毒＞直接滅活＞感染病毒后加藥。這說明CEGP具有良好的抑制病毒吸附或侵入細(xì)胞的活性,在細(xì)胞外也能有效地直接殺滅病毒。

圖5 LEGP對各病毒株感染細(xì)胞抑制作用的效量關(guān)系Fig.5 Inhibition effect of the virus (LEGP)

圖6 不同給藥途徑下CEGP的抗CVB3活性Fig.6 Antiviral activity against CVB3 of CEGP based on different dosing

圖7 不同給藥途徑下CEGP的抗RSV活性Fig.7 Antiviral activity against RSV of CEGP based on different dosing

3 討論

本文初步研究了麒麟菜多糖的抗病毒活性, MTT及CPE結(jié)果顯示, CEGP及LEGP對常見的呼吸道病毒包括流感病毒(H1N1, H3N2, H5N3), 科薩奇病毒CVB3及呼吸道合胞病毒RSV都具有一定抗病毒活性, 且活性相似, 證明抗病毒多糖成分為大分子量多糖組分。并且, 隨著CEGP和LEGP濃度增大, 抗病毒活性也隨之增強(qiáng)。其中, LEGP對CVB3的作用最好, 治療指數(shù)TI高達(dá)1901, 但其抗呼吸道相關(guān)病毒活性具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。另外, 在實(shí)驗(yàn)所用濃度范圍內(nèi)(＜500 μg/mL), CEGP及LEGP對MDCK、HeLa和HEp-2細(xì)胞均無明顯毒性。不同給藥途徑下 CEGP的抗病毒作用實(shí)驗(yàn)證明, CEGP是通過阻止病毒吸附或侵入細(xì)胞以及直接殺滅病毒來保護(hù)細(xì)胞免受病毒感染。關(guān)于 CEGP是直接抑制病毒吸附于細(xì)胞上還是抑制了病毒核酸注入細(xì)胞的過程, 以及是通過哪種方式殺傷病毒, 相關(guān)機(jī)制正在進(jìn)一步研究中。

本文研究并證明了CEGP及LEGP具有抗呼吸道相關(guān)病毒活性并初步探討了抗病毒作用機(jī)制, 可針對該活性做進(jìn)一步的體內(nèi)研究, 開發(fā)出可以預(yù)防及治療呼吸道相關(guān)疾病的藥物或醫(yī)療器械等。麒麟菜易于大規(guī)模人工培養(yǎng), 藻體多糖含量高達(dá) 60%, 來源十分豐富, 為其進(jìn)一步的開發(fā)提供了有利的基礎(chǔ)。

[1] 李美玉. 金銀花體外抗呼吸道合胞病毒的作用研究[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 10(4): 420-422.

[2] 張復(fù)春, 胡鳳玉.新型甲型H1N1流感研究進(jìn)展[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版), 2009, 30(5): 481-485.

[3] Liu Ge, Xiong Sheng, Xiang YangFei, et al. Antiviral activity and possible mechanisms of action of pentagalloylglucose (PGG) against influenza A virus[J]. Arch Virol, 2011. 156(8): 1359-1369.

[4] 劉石生, 魏東, 王一飛, 等. 紫球藻胞外多糖抗柯薩奇 B_3病毒活性研究 I [J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2005, 9(1): 16-20.

[5] 劉石生, 魏東, 朱桂芳, 等. 紫球藻胞外多糖抗柯薩奇B_3病毒活性[J]. 華南理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2005, 33(2): 82-85.

[6] 王亞峰. 余甘根苷B抗柯薩奇病毒B3作用及機(jī)制的初步研究[D]. 廣州: 暨南大學(xué), 2009.

[7] 王長云, 管華詩. 多糖抗病毒作用研究進(jìn)展Ⅱ. 硫酸多糖抗病毒作用[J]. 生物工程進(jìn)展, 2000, 20(02): 3-8.

[8] Mayer A M, Hamann M T. Marine pharmacology in 2001—2002: marine compounds with anthelmintic, antibacterial, anticoagulant, antidiabetic, antifungal, antiinflammatory, antimalarial, antiplatelet, antiprotozoal, antituberculosis, and antiviral activities; affecting the cardiovascular, immune and nervous systems and other miscellaneous mechanisms of action[J]. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol, 2005. 140(3-4): 265-286.

[9] Yasuhara-Bell J, Lu Y. Marine compounds and their antiviral activities[J]. Antiviral Res, 2010. 86(3): 231-240.

[10] 葉紹明, 岑穎洲, 張美英, 等. 麒麟菜硫酸酯多糖體外抗病毒作用的研究[J]. 中國海洋藥物, 2007, 26(3): 14-19.

[11] 王懷玲, 董棟, 鄒沐平, 等. 瓊枝麒麟菜多糖超聲提取工藝及皮膚修復(fù)活性研究[J]. 中國海洋藥物, 2014, 33(6): 65-70.

[12] 張穎, 岑穎洲, 黃日明, 等. 南海七種海藻多糖的抗病毒活性初步研究[J]. 病毒學(xué)報, 2006, 22(04): 282-285.

[13] 郝靜. 裙帶菜莖硫酸多糖抗病毒活性及其作用機(jī)理的初步研究[D]. 廣州: 暨南大學(xué), 2008.

Conclusion: CEGP and LEGP showed great potential in respirovirus inhibition.

(本文編輯: 康亦兼)

Anti-respirovirus activity of aEucheuma gelatinaepolysaccharide

ZOU Mu-ping1,2, DONG Dong1, WANG Huai-ling1, WANG Qiao-li1, PU Han-lin2, WANG Yi-fei1
(1. Guangzhou Jinan Biomedicine Research and Development Center, Guangzhou 510632, China; 2. Guangzhou Jinan Bioengineering Institute, Guangzhou 510632, China)

Nov., 28, 2014

Eucheuma gelatinaepolysaccharides; antiviral activity; respirovirus

Objective: To evaluate the anti-respirovirus effects of crudeEucheuma gelatinaepolysaccharides (CEGP) and large molecular weight components (MW ＞ 500 kDa, LEGP). Method: The Reed-Muench method was used to calculate the titer of the influenza virus (H1N1, H5N3, and H3N2), coxsackie virus (CVB3), and the respiratory syncytial virus (RSV-long). The maximum no toxicity concentrations of CEGP and LEGP to each cell line (MDCK, HeLa, and HEp-2) were selected by the cytopathic effect (CPE) method. The antiviral effects of CEGP and LEGP were evaluated by the MTT and CPE methods. Results: Both CEGP and LEGP showed significant and similar inhibition effects on the influenza virus (H1N1, H5N3, and H3N2), CVB3, and RSV-long. CVB3 and RSV were more sensitive to EGP (CEGP and LEGP) compared with the influenza virus.

Q

A

1000-3096(2015)12-0015-06

10.11759/hykx20141128001

2014-11-28;

2015-06-05

廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)科技攻關(guān)與研發(fā)(A201301C06)資助

鄒沐平(1990), 女, 廣東揭陽人, 碩士研究生; 研究方向:海洋藥物, 電話: 15002004602, E-mail: zoumuping@163.com; 王一飛,通信作者, 教授, 研究方向: 生物醫(yī)藥, 電話: 020-85223426, E-mail: twangyf@jnu.edu.cn; 蒲含林, 通信作者, 男, 副研究員, 研究方向: 天然產(chǎn)物純化、合成及活性研究, 電話: 13560136797, E-mail: tphl@jnu.edu.cn