雷小燦，張海航，崔奎青，劉福航，劉慶友，石德順

（廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，南寧530005）

哺乳動物卵泡發(fā)育一直是發(fā)育生物學(xué)的研究重點，卵泡發(fā)育是受各種因素精密調(diào)控的復(fù)雜過程［1-4］。顆粒細胞在促性腺激素的作用下，自身合成分泌的一系列受體和細胞因子等通過縫隙連接間接調(diào)控卵泡膜細胞和卵母細胞的生長發(fā)育直至成熟，從而調(diào)控卵泡的生長、成熟或者閉鎖［5］。因此，顆粒細胞的增殖與凋亡對卵泡發(fā)育起重要作用，亦是卵泡發(fā)育不同階段的標志。研究發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白1（Bone morphogenetic protein 1，BMP1）基因是一類屬于蝦紅素家族的金屬蛋白酶［6］，具有分離原骨膠原C末端前肽，參與形成細胞外基質(zhì)，誘導(dǎo)軟骨和骨的生成，亦可通過分離鍵蛋白而參與早期胚胎發(fā)育及卵泡發(fā)生等功能［7］。BMP1基因在爪蟾、家雞、小鼠和綿羊等動物的胚胎和卵泡發(fā)育過程中的表達模式已有相關(guān)報道［8-11］。并已闡明BMP1基因通過BMP1／chordin／BMPs的機制［12-13］，激活GDF8／GDF11［14-15］、TGF-β1［16］和IGF［17］等因子的分子機制發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，表明BMP1基因在動物卵泡發(fā)生過程中具有重要的作用。此外，有研究結(jié)果證實，金屬蛋白酶家族其他成員（如MMP-2、MMP-3、MMP-9［7，18-19］等因子）在卵泡胚胎發(fā)育過程中的表達規(guī)律，闡明MMP-1具有促進肺泡上皮細胞的增殖與遷移，并抑制其凋亡的功能［20］，MMP-8具有促進血管平滑肌細胞的增殖能力［21］。但BMP1基因在水牛卵泡發(fā)生中的功能研究卻鮮有報道，開展對BMP1基因的研究將有助于人們從基因角度進一步闡明動物卵泡的形成和胚胎發(fā)育的機制，對醫(yī)學(xué)和畜牧業(yè)等領(lǐng)域?qū)a(chǎn)生積極的影響。而BMP1基因是否具有調(diào)控卵巢顆粒細胞的生長功能迄今還未見相關(guān)報道，因此，BMP1基因是否通過調(diào)控水牛顆粒細胞的增殖與凋亡從而參與水牛卵泡發(fā)育過程有待進一步深入研究證實。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用卵巢采自南寧市魯班路屠宰場。

1.2 主要試劑

BMP1基因重組蛋白購自R＆D System公司（1927-Z-010），抗BMP1抗體購自Santa Cruz公司（SC-27324），F(xiàn)as、Bax和Caspase-9的抗體和二抗均購自Proteintech公司（13098-1-AP，50599-1-Ig，10380-1-AP），β-actin抗體購自Cell siglaling公司（＃4967）。CCK-8試劑盒、Trizol試劑、DMEM試劑購自Life Technology公司，熒光定量SYBR Green Master Mix購自Roche公司，一步快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫已知的牛和水牛各基因序列，利用Oligo6.0軟件分別設(shè)計BMP1、細胞周期關(guān)鍵蛋白Cyclin D1和Cyclin D2，PCNA（增殖細胞核抗原）以及細胞凋亡信號通路相關(guān)因子的熒光定量引物及18S r RNA內(nèi)參基因的引物，引物序列見表1。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.2 水牛顆粒細胞的體外分離 從屠宰場收集水牛卵巢，30 min內(nèi)送回實驗室，用帶有10號針頭的注射器分別收集卵巢表面直徑為2～6 mm卵泡的卵泡液，體視顯微鏡下揀出卵母細胞，將卵泡液收集于15 m L的離心管中，37℃靜置5 min，抽取上清，1 200 r·min-1離心5 min，棄上清，加DMEM重懸沉淀，1 200 r·min-1離心3 min，取上清，在1 200 r·min-1離心5 min，收集細胞沉淀，用DMEM洗2～3遍，即為較純凈的水牛顆粒細胞。

1.3.3 水牛顆粒細胞的體外培養(yǎng) 收集好的水牛顆粒細胞按照適當?shù)募毎麧舛?，在含?0%FBS（胎牛血清）的DMEM的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別于6 cm的培養(yǎng)皿中，接種細胞數(shù)為每孔106個；分別培養(yǎng)24、48、72和96 h，通過胰酶消化的方法收集細胞，進行總RNA的提取。BMP1重組蛋白和抗BMP1抗體添加試驗：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加0、5、15、2 5和50 ng·m L-1BMP1重組蛋白和0、5 0、1 0 0、200和400 ng·m L-1抗BMP1抗體，并培養(yǎng)于6 cm培養(yǎng)皿中，接種細胞數(shù)為每孔106個；分別于體外培養(yǎng)72 h后，收集細胞，用于總RNA或者總蛋白的提取。顆粒細胞增殖試驗：采用96孔板進行培養(yǎng)，接種細胞數(shù)為每孔104個。并于培養(yǎng)后72 h左右，按照試劑盒說明書進行檢測。顆粒細胞在37

℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后對培養(yǎng)的細胞進行清洗換液，之后繼續(xù)培養(yǎng)至試驗所需時間。

表1 qRT-PCR引物序列及相關(guān)條件Table 1 Primers for quantitative PCR

1.3.4 CCK-8檢測水牛顆粒細胞的增殖 添加不同濃度BMP1重組蛋白或者抗BMP1抗體的顆粒細胞，于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液。在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)避光孵育1.5 h，在酶標儀中通過450 nm吸收波長測定吸光度。每組試驗重復(fù)3次，每次試驗設(shè)5個重復(fù)，利用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，不同字母代表差異顯著（P＜0.05）。

1.3.5 RNA的提取利用 Trizol法分別提取培養(yǎng)不同時間和添加不同濃度BMP1重組蛋白及抗BMP1抗體的水牛顆粒細胞總RNA。RNA提取后，通過分光光度計及電泳檢測其純度和完整性，并置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。按照一步快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物公司）進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄體系20μL：2μg總RNA，5＊TransScript Allin-One Super Mix for qPCR 4μL，gDNA Remover 1 μL，RNase-free Water補足20μL，輕輕混勻，42℃孵育15 min，85℃滅活5 min，4℃終止。

1.3.6 qRT-PCR q RT-PCR的反應(yīng)體系為20 μL：RT-PCR產(chǎn)物1μL，2×FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）10μL，Primer F／R（10 μmol·L-1）0.6μL，RNase Free water 8.4μL。反應(yīng)條件：95℃變性10 min；95℃15 s，60℃（或者55℃）1 min，40個循環(huán)，試驗對每個樣品進行3次重復(fù)。用內(nèi)參18S r RNA對其進行標準化，運用2-△△Ct方法計算目的基因的相對表達量，組間差異利用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，不同字母代表差異顯著（P＜0.05）。

1.3.7 Western blotting 收集添加不同濃度BMP1重組蛋白和抗BMP1抗體的水牛顆粒細胞，分別加入RIPA（RIPA加入量為細胞體積的10倍）裂解液裂解組織，（并添加PMSF蛋白酶抑制劑，終濃度為100μg·m L-1，防止蛋白降解）。在冰上裂解30 min后，12 000 r·min-1離心10 min，按體積比加入4×loading buffer，沸水煮沸變性10 min。將變性后的蛋白進行SDS-PAGE（10%分離膠）分離。電泳結(jié)束后，利用伯樂半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)移至NC（硝酸纖維素膜）膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5%脫脂牛奶室溫封閉45 min。TBST洗3遍后，每次10 min，各基因的抗體用一抗稀釋液稀釋后，4℃冰箱孵育過夜。第2天，用TBST徹底洗膜3次，每次10 min，孵育山羊抗兔IgG-HRP二抗室溫孵育1 h，TBST徹底洗膜3次后，將NC膜放置在伯樂成像系統(tǒng)上，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液，成像并用Imagelab分析試驗結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 BM P1基因在水牛顆粒細胞中體外培養(yǎng)不同時間的表達

為探討B(tài)MP1基因在水牛顆粒細胞中的表達情況，通過qRT-PCR的方法檢測BMP1基因在體外培養(yǎng)水牛顆粒細胞0、24、48、72和96 h的表達規(guī)律。結(jié)果顯示（圖1），以體外分離的顆粒細胞0 h為參照，BMP1基因隨著顆粒細胞在體外培養(yǎng)時間的延長其相對表達量逐漸增高，且差異顯著。體外培養(yǎng)達到96 h時，BMP1基因在顆粒細胞中的表達量最高。顆粒細胞培養(yǎng)24～48 h，BMP1基因相對表達量無顯著差異，培養(yǎng)到48 h后，BMP1基因的表達開始顯著升高，顆粒細胞培養(yǎng)72～96 h，BMP1基因相對表達量無顯著差異。

圖1 BMP1基因在體外培養(yǎng)顆粒細胞不同時間的表達Fig.1 The expression of BMP1 in the different time of granulosa cells cultured in vitro

2.2 BMP1基因?qū)λｎw粒細胞增殖的影響

在體外培養(yǎng)的顆粒細胞中添加不同濃度的BMP1重組蛋白和抗BMP1抗體，利用CCK-8試劑盒檢測顆粒細胞的增殖情況。結(jié)果顯示（圖2），添加了BMP1重組蛋白的顆粒細胞的增殖特性顯著增強，且25 ng·m L-1BMP1重組蛋白可以顯著提高體外培養(yǎng)水牛顆粒細胞的增殖（圖2A）；抗BMP1抗體添加試驗結(jié)果表明，隨著抗體濃度的升高，顆粒細胞的增殖特性顯著下降，400 ng·m L-1抗BMP1抗體能夠顯著抑制顆粒細胞的增殖，隨著抗BMP1抗體濃度的升高，其抑制效率逐漸增強，并具有明顯的計量依賴性（圖2B）。

圖2 BMP1基因?qū)w外培養(yǎng)水牛顆粒細胞增殖特性的影響Fig.2 The Effect of BMP1 on the proliferation activity of buffalo granulosa cells

2.3 BMP1基因?qū)︻w粒細胞增殖的分子機制

BMP1可以顯著促進體外培養(yǎng)水牛顆粒細胞的增殖，以18S為內(nèi)參基因，應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)研究BMP1重組蛋白和抗BMP1抗體對細胞周期關(guān)鍵蛋白和增殖細胞核抗原表達的影響（圖3）。結(jié)果顯示，BMP1重組蛋白可以顯著提高Cyclin D1、Cyclin D2和PCNA在顆粒細胞中的表達，其中25 ng·m L-1BMP1重組蛋白與其他各組差異顯著（圖3A）；抗BMP1抗體添加試驗結(jié)果表明，隨著抗BMP1抗體濃度的升高，Cyclin D1、Cyclin D2和PCNA的相對表達量顯著下降，并且具有明顯的計量依賴性，這3個基因在400 ng·m L-1抗BMP1抗體添加組中表達量最低（圖3B）。

2.4 BMP1基因調(diào)控顆粒細胞凋亡的分子機制

以18S r RNA為內(nèi)參基因，qRT-PCR檢測BMP1基因?qū)λ劳鍪荏w途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路3種細胞凋亡途徑的關(guān)鍵作用因子在顆粒細胞中mRNA水平的表達情況。結(jié)果顯示（圖4），BMP1重組蛋白添加組可以顯著抑制死亡受體途徑中Fas、FasL、TNFa、TNFR1基因，線粒體途徑中Cytochrome C和Apaf 1基因，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑中Chop基因的表達（圖4A），抑制Caspase家族Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9基因的表達，促凋亡因子Bax的表達亦受到抑制，BMP1重組蛋白可以顯著提高抗凋亡因子Bcl-2的表達（圖4C）。在抗BMP1抗體添加組，各促凋亡基因的相對表達量顯著升高，抗凋亡因子Bcl-2的表達量顯著下降（圖4B和圖4D）。Western blotting檢測Fas、Bax和Caspase-9蛋白水平的表達情況，結(jié)果顯示（圖5），BMP1重組蛋白可以顯著抑制Fas、Bax和Caspase-9蛋白表達（圖5A），而抗BMP1抗體可以顯著提高它們的表達（圖5B），經(jīng)過半定量分析（圖5C和5D），這些基因在蛋白和m RNA表達趨勢趨于一致。

圖4 BMP1基因?qū)Φ蛲鲂盘柾废嚓P(guān)因子的mRNA表達變化的影響Fig.4 BMP1 affect the genes expression at mRNA level associated with apoptosis signaling pathways

3 討 論

顆粒細胞從卵原細胞的生長，到原始卵泡的啟動、募集，初級卵泡和次級卵泡的形成，以及有腔卵泡的選擇和優(yōu)勢化過程都發(fā)生了不同的形態(tài)和功能變化。研究表明BMP1基因在綿羊幼年和成年時期的卵巢中均有表達，并從初級卵泡～次級卵泡等不同階段的卵泡發(fā)育過程中持續(xù)表達，且特異性地在顆粒細胞表達［11］，筆者前期的研究結(jié)果表明，BMP1基因顯著的表達于水牛、豬和小鼠的顆粒細胞中（未發(fā)表）。利用顆粒細胞作為細胞模型研究BMP1基因在水牛卵泡發(fā)生中的功能是可行和可信的。本研究結(jié)果亦表明，BMP1基因在顆粒細胞中的表達隨著體外培養(yǎng)時間的延長而逐漸增加，說明BMP1基因的表達隨著顆粒細胞的增殖而逐漸增強。有研究表明通過CCK8檢測MMP-1具有促進肺泡上皮細胞的增殖與遷移，并抑制其凋亡的功能［20］；MMP-8具有促進血管平滑肌細胞的增殖能力［21］。但目前對于BMP1基因能否促進細胞的增殖尚無報道，本研究證實添加BMP1重組蛋白可以顯著提高體外培養(yǎng)顆粒細胞的增殖能力。

圖5 BMP1基因?qū)Φ蛲鲂盘柾废嚓P(guān)因子的蛋白表達變化的影響Fig.5 BMP1 affect the genes expression in protein level associated with apoptosis signaling pathways

有研究表明，細胞周期關(guān)鍵蛋白D（Cyclin D）在細胞G1期向S期過渡時具有重要作用［22］，Cyclin D 1的過度表達可以使細胞提前進入S期，從而縮短G1期進而縮短細胞周期［23］。Cyclin D 1和Cyclin D 2在小鼠處于增殖過程中的生殖母細胞中表達量較高［24］；在牛雌激素活躍的優(yōu)勢化卵泡中顆粒細胞Cyclin D 2的表達顯著高于雌激素非活躍組的卵泡［25］，表明Cyclin D在卵泡發(fā)育過程中顆粒細胞的增殖發(fā)揮重要作用。且在Cyclin D 2敲除的小鼠中發(fā)現(xiàn)顆粒細胞的增殖能力受損，且卵泡發(fā)育受阻，不再增大［26］。結(jié)合本研究結(jié)果顯示，添加BMP1重組蛋白可以顯著提高體外培養(yǎng)顆粒細胞的增殖能力，且能顯著提高Cyclin D 1和Cyclin D 2的表達，說明BMP1基因具有促進顆粒細胞增殖的功能。此外，PCNA可以作為研究細胞增殖活性的一種標志物，研究表明PCNA在大鼠卵巢原始卵泡中的顆粒細胞和卵母細胞中均不表達［27］，但從初級卵泡開始，顆粒細胞和卵母細胞中均能觀察到PCNA的表達，且隨著卵泡的發(fā)育，其表達有逐漸增強的趨勢。在牛和豬等卵巢中也得到了相似的結(jié)果［28］。PCNA的表達伴隨著卵泡直徑的逐漸增大，顆粒細胞的增殖而逐漸增加，本研究結(jié)果表明，BMP1基因能夠促進PCNA的表達，再次揭示BMP1基因具有促進顆粒細胞增殖的能力。

Cyclin D也具有一定的抗凋亡功能［29］，在小鼠造血干細胞的生長過程中需要Cyclin D的表達，且Cyclin D通過抑制Fas和FasL的表達進而抑制造血干細胞的凋亡，敲除Cyclin D的細胞中Fas和Caspase-8的表達明顯升高。特別是MMP也通過調(diào)控促凋亡和抗凋亡因子發(fā)揮凋亡作用，其中MMP-2［30］、MMP-3［31］、MMP-7［32］和MMP-9［33］等都具有抗凋亡的活性。也有研究表明，MMP-7和MMP-3的組織抑制劑（TIMP3）通過激活死亡受體Fas和TNF-R 1的表達，激活Caspase-8和Caspase-3進而誘導(dǎo)黑色素瘤細胞的凋亡［34］。但是關(guān)于BMP1基因參與調(diào)控細胞凋亡的機制還未見相關(guān)報道。本研究的結(jié)果表明，BMP1重組蛋白可以顯著抑制促凋亡基因的表達，并顯著抑制Caspase基因的表達，表明BMP1基因通過促進細胞增殖進而相對抑制細胞的凋亡。此外，通過BMP1基因?qū)毎蛲鲂盘柾废嚓P(guān)因子的表達變化趨勢來看，BMP1基因亦可能主要通過死亡受體途徑來影響細胞的凋亡，這種機制可能與BMP1基因具有特殊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，亦或是一種分泌型的蛋白有關(guān)［35］。迄今未見相關(guān)研究表明MMP或BMP 1通過線粒體途徑或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑參與調(diào)控細胞凋亡機制的報道，本研究證實了這兩個細胞凋亡信號通路中關(guān)鍵基因的表達變化，說明BMP1基因有可能通過調(diào)控這些基因而參與抑制細胞的凋亡，但從各基因的表達趨勢上，BMP1基因在這兩個信號通路中并不發(fā)揮主要作用，且其明確的作用信號通路需要進一步研究證實。

本研究結(jié)果表明，BMP1基因可能具備某種生長因子的活性，能夠促進體外培養(yǎng)水牛顆粒細胞的增殖并且能抑制其凋亡。表明BMP1基因在水牛卵泡發(fā)生過程中可能具有重要的功能，以及其對腔前卵泡、小腔卵泡體外成熟的影響，為原始卵泡庫的充分開發(fā)利用提供理論依據(jù)，并對闡明調(diào)控卵泡選擇優(yōu)勢化和排卵的分子機制，對系統(tǒng)開發(fā)利用大家畜卵泡奠定理論基礎(chǔ)。但BMP1基因參與動物卵泡發(fā)生的分子機制還待進一步深入研究。

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