姜英翰，郝 巖，潘鑫燕，黎貴蕓，王 麗，陳 玥，楊舉倫

乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的長期復(fù)雜的演變過程［1-4］。其中，抑癌基因的甲基化及其導(dǎo)致的表達(dá)沉默在乳腺癌的發(fā)生和演變過程中起重要作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，P16［5］、RASSF1A［6］、NOEY2［7］、WWOX［8］、PALB2［9］、BRCA1、BRCA2 等抑癌基因均與乳腺癌相關(guān)。結(jié)腸腺瘤性息肉病(APC)基因是重要的抑癌基因，Esteller等［10］在結(jié)直腸癌、胃癌、食管癌、肝癌、胰腺癌等消化道腫瘤中均檢測到了APC基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化。Liu等［11］研究發(fā)現(xiàn)，APC基因啟動(dòng)子1A區(qū)出現(xiàn)的高甲基化與乳腺癌存在一定的關(guān)聯(lián)性。但是，目前尚不清楚APC基因的甲基化是發(fā)生在細(xì)胞癌變以后還是在癌前病變的某一階段。我們以往的研究結(jié)果提示，APC基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化未參與乳腺癌的發(fā)生過程［12］。但是，該結(jié)果僅能反映該細(xì)胞模型中APC基因甲基化的狀態(tài)，不能反映其他細(xì)胞系及原發(fā)性乳腺癌組織的甲基化狀態(tài)。因此本實(shí)驗(yàn)通過甲基化特異性PCR(MSP)檢測正常乳腺組織(NBT)、乳腺普通型導(dǎo)管增生(UDH)、非典型導(dǎo)管增生(ADH)、原位導(dǎo)管癌(DCIS)、浸潤性導(dǎo)管癌(IDC)中APC基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，并使用定量聚合酶鏈反應(yīng)(QPCR)技術(shù)檢測APC基因的mRNA表達(dá)水平，觀察APC基因的甲基化狀態(tài)和基因表達(dá)在乳腺癌發(fā)生過程中的變化，探討APC基因甲基化和基因表達(dá)與乳腺癌發(fā)生的關(guān)系及其在乳腺癌早期診斷和治療中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源:收集成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院2010—2012年手術(shù)切除的46例 IDC標(biāo)本、27例UDH標(biāo)本、17例癌旁NBT標(biāo)本及存檔蠟塊中20例DCIS標(biāo)本、13例ADH標(biāo)本，均為女性，一般情況見表1。其中，IDC標(biāo)本TNM分期:Ⅰ期10例，Ⅱ期28例，Ⅲ期8例;組織學(xué)分級(jí):Ⅰ級(jí)15例，Ⅱ級(jí)24例，Ⅲ級(jí)7例;腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例;人表皮生長因子受體-2(HER-2)陽性16例，雌激素受體(ER)陽性29例，孕激素受體(PR)陽性22例，DCIS樣本HER-2陽性2例，ER陽性11例，PR陽性9例。新鮮標(biāo)本在手術(shù)切除后放于液氮中速凍，之后置于-80℃低溫冰箱中保存。石蠟標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。上述標(biāo)本均經(jīng)病理醫(yī)師檢查驗(yàn)證和歸類。

1.1.2 主要試劑:基因組DNA提取試劑盒、D2000 DNA marker、普通質(zhì)粒小提試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司;QIAamp DNA FFPE Tisuue Kit、EpiTect Bisulfite Kit均購自 QIAGEN公司;BamH I酶、Sal I酶購置Fermentas公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取:新鮮冰凍組織DNA提取按照天根公司DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，石蠟組織基因組DNA提取按照QIAGEN公司QIAamp DNA FFPE Tissue Kit試劑盒說明書進(jìn)行操作。用紫外分光光度儀檢測提取DNA的含量和純度。

表1 5種乳腺切除標(biāo)本患者臨床資料

1.2.2 MSP方法

1.2.2.1 DNA的亞硫酸氫鹽修飾:基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾采用QIAGEN公司的EpiTect Bisulfite Kit試劑盒，修飾后樣品于-20℃避光存儲(chǔ)。

1.2.2.2 MSP擴(kuò)增:利用 MethyI Primer Express V1.0設(shè)計(jì)APC基因MSP引物，目的片段大小均為142 bp，甲基化引物序列:MF 為5＇-TGTTTTATTGCGGAGTGC-3＇，MR 為 5＇-ACAACCACATATCGATCACG-3＇。未甲基化引物序列:UF 為 5＇-TTGTGTTTTATTGTGGAGTGT-3 ＇，UR 為 5 ＇-ACAACCACATATCAATCACATAC-3＇。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。MSP反應(yīng)中，以正常人外周血淋巴細(xì)胞基因組作為陰性對(duì)照，以人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞基因組DNA作為陽性對(duì)照，以去離子水作為空白對(duì)照。PCR反應(yīng)體系:去離子水4.75μl，2×GC緩沖液12.5 μl，dNTPs 2.5 μl，上下游引物各 2 μl，甲基化修飾后的DNA 1μl，DNA聚合酶0.25μl。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min，95℃變性40 s，67℃退火40 s，72℃延伸 40 s，25 個(gè)循環(huán)，72℃后延伸10 min。

1.2.2.3 結(jié)果判定:PCR產(chǎn)物用1%～2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳觀察。若只擴(kuò)增出甲基化產(chǎn)物，說明此樣本目的基因發(fā)生了完全甲基化;若只擴(kuò)增出未甲基化產(chǎn)物，則此樣本目的基因未發(fā)生甲基化;若同時(shí)擴(kuò)增出甲基化和未甲基化產(chǎn)物，說明此樣本發(fā)生部分甲基化。完全甲基化和部分甲基化均計(jì)為甲基化檢測陽性。

1.2.2.4 基因甲基化水平的積分光密度(IOD)判定:使用Quantity One軟件測定甲基化條帶(M)和未甲基化條帶(U)的IOD，通過計(jì)算IODM/(IODM+IODU)，判定APC基因的甲基化水平。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測APC基因mRNA表達(dá)水平:Trizol提取總RNA，按照Fermentas cDNA第一鏈合成試劑盒操作合成cDNA第一鏈。APC基因引物序列:F 為 5＇-ATGATTGCTATGGGAAGT-3＇，R 為 5＇-TCTGTTGCTGGATGGT-3＇，產(chǎn)物大小 455 bp。內(nèi)參基因GAPDH引物序列:F為5＇-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3＇，R 為 5＇-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3＇，產(chǎn)物大小108 bp。采用BIO-RAD CFX96TMReal-time System進(jìn)行檢測。PCR反應(yīng)體系:去離子水3μl，EvaGreen Supermix 7.5 μl，上下游引物 1 μl，模板cDNA 2.5μl。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3 min，95℃變性 10 s，60℃退火 20 s，72℃延伸 20 s。結(jié)果使用2ΔΔct法計(jì)算APC基因的相對(duì)表達(dá)量，以NBT為對(duì)照，內(nèi)參GAPDH做樣本內(nèi)校正。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以中位數(shù)±四分位間距(M±Q)表示，應(yīng)用秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，應(yīng)用χ2檢驗(yàn);相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 APC基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài) 用APC基因甲基化和未甲基化引物分別對(duì)17例NBT，27例UDH，13例ADH，20例DCIS，46例IDC標(biāo)本中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，見圖1。NBT、UDH、ADH、DCIS及IDC 的甲基化率分別為 0、0、69.23%(9/13)、90.00%(18/20)及80.43%(37/46)。ADH、DCIS、IDC 甲基化率均高于NBT及UDH(P＜0.05)，但3種標(biāo)本甲基化率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 APC基因的甲基化水平 APC基因的甲基化水平IDC為0.557±0.306，ADH為0.070±0.147，DCIS為0.298±0.496，IDC APC基因的甲基化水平高于ADH和 DCIS(P＜0.05)，但 ADH和 DCIS比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 APCmRNA在IDC中的表達(dá) 分別抽取26例IDC、10例NBT樣本，比較APC mRNA表達(dá)量的差異，結(jié)果顯示IDC為0.120±0.131，NBT為1.161±0.312，IDC低于 NBT(P＜0.05)。

2.4 IDC中APC基因甲基化狀態(tài)與mRNA表達(dá)的關(guān)系 26例IDC中，APC mRNA的表達(dá)量未甲基化標(biāo)本為 0.319±0.100，完全甲基化標(biāo)本中為0.036±0.020，部分甲基化標(biāo)本中為 0.071±0.070，未甲基化標(biāo)本中的表達(dá)量高于完全甲基化和部分甲基化標(biāo)本(P＜0.05)，但完全甲基化和部分甲基化標(biāo)本間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。APC基因甲基化水平與其mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.469，P=0.016)。

2.5 APC基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與IDC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 APC基因甲基化狀態(tài)和水平均與患者年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、HER-2、ER、PR 無關(guān)(P ＞0.05)，見表2。

圖1 5種乳腺組織標(biāo)本結(jié)腸腺瘤性息肉病基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)NBT為正常乳腺組織，UDH為乳腺普通型導(dǎo)管增生，ADH為非典型導(dǎo)管增生，DCIS為原位導(dǎo)管癌，IDC為浸潤性導(dǎo)管癌;Ma為D2000 Marker，從上到下依次為250 bp、100 bp;1～6:不同樣本編號(hào);NC為陰性對(duì)照，PC為陽性對(duì)照，BC為空白對(duì)照;U為未甲基化引物，M為甲基化引物

3 討論

UDH、ADH、DCIS是 3 種乳腺癌前病變［13］。其進(jìn)展為IDC的風(fēng)險(xiǎn)較正常人依次增加，研究這些癌前病變的分子遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)變化對(duì)于探討乳腺癌發(fā)生的分子機(jī)制及早期診斷具有重要意義。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與基因的遺傳學(xué)改變和表觀遺傳學(xué)改變有關(guān)。表觀遺傳學(xué)改變是指基因表達(dá)水平發(fā)生變化而DNA序列未發(fā)生變化的可遺傳性改變，包括DNA甲基化、組蛋白修飾與染色體重塑。研究證實(shí)，DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)改變的主要形式。其中，抑癌基因異常高甲基化在細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的過程中發(fā)揮重要作用。APC基因是重要的抑癌基因，其功能主要是通過參與Wnt信號(hào)途徑，影響細(xì)胞分裂、黏合和遷移等。APC基因異?？蓪?dǎo)致在胞質(zhì)內(nèi)聚集的β-catenin轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，激活細(xì)胞增殖相關(guān)基因，引起Wnt信號(hào)通路異常，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［14-15］。

表2 APC基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)及水平與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Lee等［16］在乳腺癌患者乳頭抽取液提取的DNA中發(fā)現(xiàn)APC基因的高甲基化。Jin等［17］也在原發(fā)性乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)APC基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化，這些證據(jù)提示APC基因的異常甲基化與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)。但是上述研究都局限于用乳腺組織作為研究對(duì)象，缺乏癌前病變的資料，結(jié)果只能說明APC基因的異常甲基化可能與乳腺癌有關(guān)，對(duì)于乳腺組織從UDH發(fā)展到IDC整個(gè)過程中，APC基因的甲基化狀態(tài)尚不清楚。為此，本實(shí)驗(yàn)將UDH、ADH、DCIS及IDC納入研究對(duì)象，研究APC基因的甲基化狀態(tài)在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

本研究結(jié)果顯示，APC基因在 NBT、UDH、ADH、DCIS及IDC乳腺組織中的甲基化率分別為0、0、69.23%、90.00%及80.43%。隨著病變程度的增加，ADH、DCIS與IDC甲基化率高于 NBT與UDH，但ADH、DCIS與IDC甲基化率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為此，我們利用Quantity One軟件從甲基化水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)IDC組的甲基化水平高于ADH組與DCIS組，即IDC組甲基化DNA拷貝數(shù)占總DNA拷貝數(shù)的比例明顯高于ADH、DCIS組。結(jié)合兩方面的結(jié)果進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)在乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞癌變的過程中，APC基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化程度是逐漸增高的。其中，IDC樣本的甲基化程度最高，DCIS和ADH次之，UDH和NBT最低。Hoque等［18］研究發(fā)現(xiàn)，APC、CTNNB1 與 CDH1 基因的甲基化率和水平IDC標(biāo)本高于NBT標(biāo)本。Park等［19］研究發(fā)現(xiàn)，APC、DLEC1、HOXA1 和 RASSF1A 4 種基因啟動(dòng)區(qū)CpG島的甲基化率和水平在ADH中高于NBT。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌發(fā)生過程中APC基因的甲基化程度隨著病變程度的加重而升高，與報(bào)道一致。提示APC基因的異常甲基化狀態(tài)可能對(duì)乳腺癌的發(fā)生起到了促進(jìn)作用，通過檢測APC基因的甲基化狀態(tài)可以預(yù)測乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，甲基化標(biāo)本(包括部分甲基化和完全甲基化)的APC mRNA表達(dá)水平明顯低于未甲基化標(biāo)本，且26例IDC中APC基因的甲基化水平和其mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明乳腺癌發(fā)生過程中APC基因啟動(dòng)子的異常甲基化是導(dǎo)致其表達(dá)失活的重要原因之一，與 Liu等［11］報(bào)道結(jié)果相符。但如果將甲基化標(biāo)本分為部分甲基化和完全甲基化，則兩組間mRNA表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，原因可能是MSP結(jié)果只能反映出引物結(jié)合部位的CpG位點(diǎn)的甲基化情況。

綜上所述，在乳腺癌中除啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化以外，可能還有其他機(jī)制導(dǎo)致了APC基因的轉(zhuǎn)錄沉默及蛋白表達(dá)障礙。因此，對(duì)于APC基因失活導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生的機(jī)制，有必要從不同角度進(jìn)行進(jìn)一步研究。

［1］ 井茹芳，李春伶，劉衛(wèi)星，等.超聲彈性成像與乳腺鉬靶攝影對(duì)乳腺癌診斷的對(duì)比研究［J］.西北國防醫(yī)學(xué)雜志，2012，33(6):624-626.

［2］ 王雅婧，劉德權(quán)，葉劍橋，等.多西他賽與表柔比星聯(lián)合或序貫化療治療局部晚期乳腺癌臨床觀察［J］.武警醫(yī)學(xué)，2014(9):921-923.

［3］ 張偉，彭大云，陳曉東，等.乳腺癌HER2基因熒光原位雜交與顯色原位雜交檢測對(duì)比研究［J］.華南國防醫(yī)學(xué)雜志，2011，25(1):13-15.

［4］ 謝曉冬，郭放，韓雅玲，等.乳腺癌轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)新理念—從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用［J］.解放軍醫(yī)藥雜志，2014，26(3):1-3.

［5］ Vallian S，Sedaghat M，Nassiri I，et al.Methylation status of p16 INK4A tumor suppressor gene in Iranian patients with sporadic breast cancer［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2009，135(8):991-996.

［6］ Kioulafa M，Kaklamanis L，Mavroudis D，et al.Prognostic significance of RASSF1A promoter methylation in operable breast cancer［J］.Clin Biochem，2009，42(10-11):970-975.

［7］ Yang J，Hu A，Wang L，et al.NOEY2 mutations in primary breast cancers and breast hyperplasia［J］.Breast，2009，18(3):197-203.

［8］ Wang X，Chao L，Jin G，et al.Association between CpG island methylation of the WWOX gene and its expression in breast cancers［J］.Tumour Biol，2009，30(1):8-14.

［9］ Evans M K，Longo D L.PALB2 mutations and breastcancer risk［J］.N Engl JMed，2014，371(6):566-568.

［10］Esteller M，Sparks A，Toyota M，et al.Analysis of adenomatous polyposis coli promoter hypermethylation in human cancer［J］.Cancer Res，2000，60(16):4366-4371.

［11］Liu Z，Yang L，Cui D X，et al.Methylation status and protein expression of adenomatous polyposis coli(APC)gene in breast cancer［J］.Chinese Journal of Cancer，2007，26(6):586-590.

［12］ 楊舉倫，David Klinkebiel，Michael J Boland，等.乳腺癌發(fā)生模型MCF10各細(xì)胞系中APC基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化及mRNA表達(dá)檢測［J］.中華病理學(xué)雜志，2006，35(1):32-36.

［13］楊舉倫.乳腺導(dǎo)管內(nèi)增生性病變是乳腺癌前驅(qū)病變［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2011，27(9):919-923.

［14］ Fearnhead N S，Britton M P，Bodmer W F.The ABC of APC［J］.Hum Mol Genet，2001，10(7):721-733.

［15］ Nelson S，Nathke I S.Interactions and functions of the adenomatous polyposis coli(APC)protein at a glance［J］.JCell Sci，2013，126(Pt 4):873-877.

［16］Lee A，Kim Y，Han K，et al.Detection of tumor markers including carcinoembryonic antigen，APC，and cyclin D2 in fine-needle aspiration fluid of breast［J］.Arch Pathol Lab Med，2004，128(11):1251-1256.

［17］ Jin Z，Tamura G，Tsuchiya T，et al.Adenomatous polyposis coli(APC)gene promoter hypermethylation in primary breast cancers［J］.Br JCancer，2001，85(1):69-73.

［18］Hoque M O，Prencipe M，Poeta M L，et al.Changes in CpG islands promoter methylation patterns during ductal breast carcinoma progression［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2009，18(10):2694-2700.

［19］ Park SY，Kwon H J，Lee H E，et al.Promoter CpG island hypermethylation during breast cancer progression［J］.Virchows Arch，2011，458(1):73-84.