杜 徽，費(fèi)洪新，張英博，仲麗麗，王曉源，劉 斌，韓玉生，李寶龍，孫 博，丑小月，周忠光

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040）

阿爾茨海默病(Al z h e i m er's d i s ea s e，A D)是一種臨床上常見的老年性疾病，其炎癥介質(zhì)受到了廣泛的關(guān)注，許多炎癥介質(zhì)例如白介素-6(I L-1β)、腫瘤壞死因子-α(TN F-α)、白介素-8(I L-8)等參與了A D的發(fā)生發(fā)展過程［1］。本課題組前期研究表明通天草水提物(Aqueous Extract from Waternut Herb，AEWH)具有改善學(xué)習(xí)記憶功能［2］、降低 A D 大鼠血清 I L-1β 水平［3］。而A EW H對A D小鼠海馬I L-1β的研究國內(nèi)外未見文獻(xiàn)報道?；谶@些,本實(shí)驗(yàn)采用A D小鼠模型為研究對象，觀察A EW H對A D小鼠海馬I L-1β水平的影響，以期為臨床治療A D提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

雄性、7月齡清潔級C57小鼠，體重(23±2)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(京2012-0001)。

1.2 藥品

AEW H由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)周忠光教授購買，田明教授制備成水煎劑、烘干后制備成干粉、-20℃保存于冰箱中備用。實(shí)驗(yàn)使用時加熱，臨時配制成A EW H溶液。吡拉西坦由湖南迪諾制藥有限公司生產(chǎn)，批號∶130325。

1.3 儀器

TGL-16G臺式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；PLZOZ-S型電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司生產(chǎn)；6100型RT-雷杜酶標(biāo)儀：美國R T公司生產(chǎn)。

1.4 試劑

Aβ1-42：S i g m a公司生產(chǎn)；I L-1β酶聯(lián)免疫試劑盒：南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號：20140401；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 AEWH的提取

實(shí)驗(yàn)稱取300g通天草放高頸燒瓶中，加5 000m L蒸餾水，攪勻，浸泡2h，煎煮2h，含通天草的藥液用干凈紗布過濾、擰干，得到第一次濾液。第一次水提物殘?jiān)俜湃敫哳i燒瓶中，再加入5 000m L蒸餾水，重復(fù)上面的過程，會得到第二次的濾液。合并2次濾液，濃縮，制備成干膏、干粉，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 A D模型的復(fù)制

C57小鼠水合氯醛麻醉后，小鼠雙側(cè)腦室一次性注入5μL凝聚態(tài)Aβ1-42(濃度為80p mol·μL-1)。同時對照組C57小鼠雙側(cè)腦室注射等量生理鹽水。

2.3 分組

復(fù)制A D模型小鼠共24只，隨機(jī)分為4組，其中模型組6只、吡拉西坦組6只、A EW H高劑量組6只、AEWH低劑量組6只。另設(shè)對照組C57小鼠6只。

2.4 給藥

選擇對照組、模型組給予生理鹽水灌胃；吡拉西坦組給予吡拉西坦 0.62g·kg-1·d--1灌胃；A EW H 高劑量組給予 A EW H 2.0g·kg-1·d-1灌胃；A EW H 低劑量組給予 A EW H 0.5g·kg-1·d-1灌胃，灌胃持續(xù)時間 18d。

2.5 海馬I L-1β的檢測

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后冰臺上操作，小鼠斷頭迅速取海馬，勻漿，靜置 1h，4℃離心機(jī) 3 000r o min-1離心 20m in，吸取上清液，分裝E P小管中，-20℃低溫保存于冰箱中備用。按酶聯(lián)免疫試劑盒說明書進(jìn)行操作，450n m波長處測定各孔吸光度(A)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出I L-1β的含量。

3 結(jié)果

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出方程：Y=0.002 3 X+0.420 6，R 2=0.874 2，計(jì)算出小鼠海馬組織IL-1β含量(見圖1)。結(jié)果表明，與對照組比較，模型組小鼠海馬組織I L-1β含量明顯升高(P＜0.05)；與模型組比較，吡拉西坦組(0.62g·kg-1·d-1)、A EW H 高劑量組(2.0g·kg-1·d-1)小鼠海馬組織I L-1β含量明顯降低(P＜0.05)；與模型組比較，A EW H低劑量組 (0.5g·kg-1·d-1)小鼠海馬組織I L-1β的含量降低不明顯(P＞0.05)(見表1)。

圖1 小鼠海馬IL-1β的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Mice hippocampus beta IL-1 standard curve

表1 AEWH對AD小鼠海馬IL-1β的影響(±s)Tab.1 AEWH impacton beta ADmice hippocampus IL-1(+s)

4 討論

采用酶聯(lián)免疫的方法檢測I L-1β的結(jié)果表明，與對照組比較，模型組小鼠海馬組織I L-1β含量明顯升高(P＜0.05)，提示模型組海馬組織I L-1β含量明顯升高，產(chǎn)生明顯的炎癥反應(yīng)，引發(fā)A D疾??；與模型組比較，A EW H高劑量組 (2.0g·kg-1·d-1)小鼠海馬組織I L-1β含量明顯降低(P＜0.05)，說明高劑量的A EW H可通過影響I L-1β的水平改善A D臨床癥狀；而與模型組比較，A EW H 低劑量組(0.5g·kg-1·d-1)小鼠海馬組織I L-1β的含量降低不明顯 (P＞0.05)，說明低劑量A EW H不可通過影響I L-1β的水平改善A D臨床癥狀。以上綜合提示采用A EW H高劑量(2.0g·kg-1·d-1)治療A D效果較好，A EW H可以通過抑制I L-1β來達(dá)到治療A D的目的。

［1］ 孫博，費(fèi)洪新，姜波，等.阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制初探［J］.中醫(yī)藥信息，2014，31（3）：26.

［2］ 魏鐵花，李寶龍，劉旭，等.通天草提取物對擬阿爾茨海默氏病模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及其海馬區(qū)組織相關(guān)蛋白表達(dá)的影響［J］.吉林中醫(yī)藥，2013，33（2）：179-181.

［3］ 邱文興，賈博宇，劉永武，等.通天草提取物對Aβ1-40所致AD大鼠血清與海馬組織中細(xì)胞因子含量的影響［J］.中醫(yī)藥信息，2012，29（2）：24-25.