嚴玉霖，高 洪，盧 琴，王修庚，趙 汝，陳 玲

(云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，云南昆明 650201)

內(nèi)毒素對大鼠小腸黏膜組織的影響及多價陽離子A的保護效應

嚴玉霖，高 洪*，盧 琴，王修庚，趙 汝，陳 玲

(云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，云南昆明 650201)

旨在揭示大腸埃希菌內(nèi)毒素(ET)對大鼠小腸黏膜的結(jié)構(gòu)、絨毛長度、上皮內(nèi)淋巴細胞(IEL)的數(shù)量和分布的影響，并探討多價陽離子A(CA)對上述指標的保護效應。選用72只140 g～150 g SPF級SD大鼠隨機分為3組，即對照組、ET組和CA保護組，經(jīng)相應處理后分別在3、4、8、12 h采集十二指腸、空腸組織作為檢測樣本，制備病理組織切片，HE染色并利用圖像分析系統(tǒng)進行分析。ET組十二指腸和空腸絨毛長度在3、4、8、12 h均顯著低于對照組和CA保護組(P<0.01)，ET組十二指腸、空腸IEL數(shù)量在3、4、8、12 h均顯著低于對照組(P<0.01)；CA保護組十二指腸和空腸IEL數(shù)量在4、8、12 h均顯著高于ET組(P<0.01)。結(jié)果顯示，ET在不同程度上能夠破壞小腸黏膜的正常組織結(jié)構(gòu)，降低小腸絨毛長度，減少IEL的數(shù)量，從而影響小腸正常的吸收和免疫功能，而CA則能明顯降低ET所導致的毒性作用，發(fā)揮其保護效應。

內(nèi)毒素；陽離子A；小腸絨毛長度；上皮內(nèi)淋巴細胞；大鼠

內(nèi)毒素(endotoxin, ET)是革蘭陰性細菌細胞壁的組成成分，其化學本質(zhì)為脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，為細菌死亡或活躍繁殖時所釋放，廣泛存在于自然界，常造成人、畜內(nèi)毒素血癥和內(nèi)毒素休克(或稱感染性休克)，并對食物、藥物、試劑和溶液造成污染，是嚴重威脅人、畜健康的致病因子[1]。內(nèi)毒素(ET)分子中含有大量帶負電荷的磷酸基團，而維持這種負電荷的存在是ET發(fā)揮生物活性的必要條件之一，在Rietschel的“干擾ET結(jié)構(gòu)或干擾含有ET結(jié)構(gòu)的膜的藥物都可以幫助殺死細菌”的理論指導下[2]，本試驗根據(jù)David S A等[3]在對內(nèi)毒素拮抗劑的研究中發(fā)現(xiàn)帶有正電荷的藥物是通過其所帶正電荷基團與內(nèi)毒素脂質(zhì)A上的PO4-結(jié)合，從而破壞內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)，并拮抗內(nèi)毒素的生物活性，多價陽離子A(polycation ion A，CA)帶有大量的正電荷基團，可使機體的抗氧化能力增強，并可直接與攜帶陰離子的脂質(zhì)A部分特異性結(jié)合，從而使脂質(zhì)A不能介導其相應的生物學活性。

腸絨毛(intestinal villus)是由腸上皮和固有層共同向腸腔突出形成的細小突起，長度約0.35 mm～1 mm，使腸腔表面積進一步擴大10倍。形狀不一，以十二指腸和空腸最發(fā)達，是營養(yǎng)物質(zhì)主要的吸收場所。本研究通過建立成年大鼠內(nèi)毒素血癥模型，對不同試驗組的大鼠腸道黏膜絨毛結(jié)構(gòu)、腸絨毛長度、上皮內(nèi)淋巴細胞(intrepithelial lymphocytes, IEL)的數(shù)量和分布的變化情況進行研究，探討ET對小腸黏膜組織結(jié)構(gòu)的影響及CA拮抗ET的保護效應，從而進一步闡述內(nèi)毒素血癥的病理過程和發(fā)病機制及CA對該病的預防和治療機制，為該病的預防、診斷、治療及新型藥物和疫苗的開發(fā)提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸埃希菌O111，B4內(nèi)毒素L2630為美國Sigma公司產(chǎn)品；陽離子A為美國AMRESCO公司產(chǎn)品；無水乙醇、二甲苯、甲醛為上海試劑一廠產(chǎn)品；72只SD大鼠由昆明醫(yī)科大學提供，體重140 g/只～150 g/只，雌(無孕)雄不拘。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理 臨床檢查確認健康后，顆粒飼料預飼養(yǎng)3 d，自由飲水，隨機分為3組：對照組(n=24)，靜脈注射等量無熱源生理鹽水；ET致病組(n=24)，尾靜脈注射ET 5 mg/kg；CA保護組(n=24)，先靜脈注射CA溶液 1 g/kg，然后在2 min內(nèi)接著尾靜脈注射ET 5 mg/kg。

1.2.2 樣品采集 3組大鼠分別第3、4、8、12 h每組各處死6只，采集小腸十二指腸、空腸組織放入100 g/L中性福爾馬林固定液，用于腸絨毛長度、上皮內(nèi)淋巴細胞檢測。

1.2.3 小腸組織切片的制備及HE染色 取固定后的十二指腸、空腸組織，用手術(shù)刀修成約1 cm×1 cm×0.2 cm大小的組織塊，進行脫水、透明、浸蠟、包埋處理后，用切片機切成厚度為5 μm左右的切片于載玻片上，進行脫水再水化，HE染色后于光學顯微鏡下觀察，根據(jù)組織細胞形態(tài)學，進行鑒別。每個樣品取5個視野，在光學顯微鏡下觀察并用圖像分析系統(tǒng)進行計數(shù)和定量分析。

2 結(jié)果

2.1 各試驗組大鼠十二指腸絨毛長度的動態(tài)變化

表1結(jié)果表明，CA保護組十二指腸絨毛長度在3、4、8、12 h均顯著高于ET致病組(P<0.01)，對照組十二指腸在絨毛長度3、4 、8、12 h均顯著高于ET致病組(P<0.01)。

表1 各試驗組大鼠十二指腸絨毛長度的動態(tài)變化Table 1 The changes of the length of the intestinal villi of the duodenum in each group

2.2 各試驗組大鼠空腸絨毛長度的動態(tài)變化

表2結(jié)果表明，CA保護組空腸絨毛長度在3、4、8、12 h均顯著高于ET致病組(P<0.01)，對照組空腸絨毛長度在3、4、8、12 h均顯著高于ET致病組(P<0.01)。

2.3 各試驗組大鼠十二指腸黏膜IEL數(shù)量的動態(tài)變化

表3結(jié)果表明，CA保護組十二指腸IEL數(shù)量在4、8、12 h均顯著高于ET致病組(P<0.01)，對照組十二指腸IEL數(shù)量在3、4、8、12 h均顯著高于ET致病組(P<0.01)。

表2 各試驗組大鼠空腸絨毛長度的動態(tài)變化Table 2 The changes of the length of the intestinal villi of the jejunum in each group

表3 各試驗組大鼠十二指腸黏膜IEL數(shù)量的動態(tài)變化Table 3 The changes of the quantity of IEL of the duodenum in each group

2.4 各試驗組大鼠空腸黏膜IEL數(shù)量的動態(tài)變化

表4結(jié)果表明，CA保護組空腸IEL數(shù)量在4、8、12 h均顯著高于ET致病組(P<0.05)，對照組空腸IEL數(shù)量在3、4、8、12h均顯著高于ET致病組(P<0.01)。

表4 各試驗組大鼠空腸黏膜IEL數(shù)量的動態(tài)變化Table 4 The changes of the quantity of IEL of the jejunum in each group

2.5 各組大鼠小腸黏膜結(jié)構(gòu)變化

由圖1可見，對照組十二指腸絨毛結(jié)構(gòu)完整且絨毛較長。ET組十二指腸絨毛結(jié)構(gòu)有明顯損傷，十二指腸絨毛中上部上皮細胞壞死、脫落、固有層裸露，且絨毛長度明顯較短。CA保護組十二指腸絨毛結(jié)構(gòu)損傷較輕，十二指腸絨毛只有頂端上皮細胞壞死、脫落、部分固有層裸露，且絨毛長度明顯較長。

由圖2～圖3可見，對照組十二指腸、空腸 IEL數(shù)量明顯較多。ET組十二指腸、空腸IEL數(shù)量明顯較少，ET+CA組十二指腸、空腸IEL較ET組數(shù)量較多。

圖1 十二指腸絨毛形態(tài)(100×)Fig.1 The morphology of the intestinal villi of the duodenum(100×)

圖2 十二指腸IEL的數(shù)量(400×)Fig.2 The quantity of IEL of the duodenum(400×)

圖3 空腸IEL的數(shù)量(400×)Fig.3 The quantity of IEL of the jejunum(400×)

3 討論

小腸絨毛長度是小腸消化吸收功能的重要指標。絨毛長度增加可使小腸吸收面積擴大，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。在指狀腸絨毛中，其長度與上皮細胞數(shù)量呈顯著相關(guān)。有研究表明營養(yǎng)缺乏可加速細胞凋亡及導致細胞壞死，且不利于組織再生，從而破壞小腸絨毛正常的組織結(jié)構(gòu)，在小腸則會導致腸絨毛表面柱狀細胞凋亡[4]，壞死，脫落。從而破壞腸黏膜機械免疫屏障。本研究結(jié)果顯示，ET致病組大鼠小腸黏膜發(fā)生一系列變化，表現(xiàn)為腸絨毛出現(xiàn)壞死、脫落，嚴重者可見大片黏膜的出血、壞死、脫落，相應固有層裸露；對照組十二指腸和空腸絨毛長度在3、4、8、12 h均顯著高于ET致病組(P<0.01)，表明ET能明顯減小十二指腸和空腸的絨毛長度，從而導致機體營養(yǎng)不足，進而加速細胞壞死和凋亡，從而破壞十二指腸和空腸黏膜正常的上皮屏障。 CA保護組十二指腸絨毛長度在3、4、8、12 h均顯著高于ET致病組(P<0.01)；CA保護組空腸絨毛長度在3、4、8、12 h均顯著高于ET致病組(P<0.01)，則說明CA在體內(nèi)能有效拮抗ET，保持小腸組織結(jié)構(gòu)形態(tài)，增加十二指腸和空腸的絨毛長度，減少ET對小腸絨毛上皮的屏障損傷。

小腸之所以能選擇性地吸收食物的營養(yǎng)成分，而阻止細菌毒素等抗原的進入，除了小腸絨毛和腸道黏膜上皮屏障的保護外，還與腸道免疫細胞的監(jiān)視與識別有關(guān)[5]。目前發(fā)現(xiàn)，腸道有兩種不同表型的淋巴細胞存在，即分散在上皮細胞層中的腸上皮內(nèi)層淋巴細胞(intrepithelial lymphocytes, IEL)和位于疏松結(jié)締組織的固有層淋巴細胞(propria lymphocytes, PL)[6]。IEL是一種黏膜免疫細胞，能抑制腸黏膜超敏反應，識別上皮細胞是否受細菌、病毒和毒素的破壞，并分泌細胞因子以發(fā)揮抗細菌、抗感染和抗局部癌變的作用。有文獻報道，在上皮中，15%的細胞為淋巴細胞，是黏膜免疫系統(tǒng)中最先接觸抗原的免疫活性細胞，它不但參與免疫反應，而且通過偽足與上皮細胞接觸加速上皮細胞再生，所以IEL在腸道黏膜中起重要的免疫屏障作用[7-10]。本研究中ET致病組十二指腸和空腸黏膜IEL數(shù)量在8 h出現(xiàn)上升趨勢，這可能是機體對ET等生物毒素免疫應答的結(jié)果，這與何亞男等[11]、李鵬等[12]的研究結(jié)果一致。但ET致病組十二指腸和空腸黏膜IEL數(shù)量在3、4、8、12 h均顯著低于對照組(P<0.01)，結(jié)果表明ET對十二指腸和空腸IEL的損害均十分明顯，抑制小腸黏膜的超敏反應，使得IEL對抗細菌，抗感染的作用降低，從而達到破壞腸黏膜免疫屏障的目的。CA保護組十二指腸和空腸黏膜IEL數(shù)量在4、8、12 h均顯著高于ET致病組(P<0.01)，表明CA能夠明顯減少ET對十二指腸和空腸黏膜IEL的損害，從而提高十二指腸和空腸黏膜的免疫屏障功能。因此，ET對小腸絨毛長度和小腸絨毛上皮屏障正常結(jié)構(gòu)的破壞，降低IEL的數(shù)量是ET對小腸黏膜損傷的重要機制之一，而CA在體內(nèi)能夠有效拮抗ET，對小腸黏膜組織的正常結(jié)構(gòu)及功能起到一定的保護效應。

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Influence of Endotoxin on Small Intestinal Mucosa and Protective Effects of CA in Rats

YAN Yu-lin,GAO Hong,LU Qin,WANG Xiu-geng,ZHAO Ru,CHEN Ling

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan,650201,China)

This study was to explore the influence of endotoxin (ET) on small intestinal mucosa tissue and the protective effects of CA in rats. 72 SD rats were randomly divided into three groups：the control group, ET group and CA group, after appropriate treatment the duodenum, jejunum tissue were collected and tested at 3, 4, 8, 12 h. The pathological slices of above tissues were prepared and stained by H.E., then were analyzed by graphical analysis system. The length of the intestinal villi of the duodenum and jejunum in ET group were shorter than in control and CA group at 3, 4, 8, 12 h (P<0.01). The quantity of IEL in the duodenum and jejunum in ET group were less than that of control and CA group at 3, 4, 8, 12 h (P<0.01). The quantities of IEL in the duodenum and jejunum in CA group were more than that of ET group at 4, 8, 12 h (P<0.01). The results indicated that ET could destroy the normal structures of small intestine, reduce the length of the intestinal villi, and consequently affect the normal absorptive and immune function. However, CA has protective effects by significantly relieving the toxic effects of ET.

endotoxin;cation A;length of intestinal villus;intrepithelial lymphocyte;rat

2014-06-17

國家自然科學基金項目(30560113)；云南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目(云財農(nóng)[2010]119號)；云南省高?？萍紕?chuàng)新團隊支持計劃資助項目(云教科[2011]14號)

嚴玉霖(1979-)，男，四川攀枝花人，副教授，博士，主要從事畜禽傳染病病理學研究。*

S852.3

:A

:1007-5038(2015)01-0053-04