楊曉嬌，周 鵬，米榮升，黃 燕，石 凱,2，王曉娟,3，王向佩,3，劉宇軒，雷曉思,2，陳兆國(guó)*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全生物性危害因子風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海 200241；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川雅安 625014;3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118)

微小隱孢子蟲(chóng)類鈣調(diào)蛋白基因的克隆與原核表達(dá)

楊曉嬌1，周 鵬1，米榮升1，黃 燕1，石 凱1,2，王曉娟1,3，王向佩1,3，劉宇軒1，雷曉思1,2，陳兆國(guó)1*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全生物性危害因子風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海 200241；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川雅安 625014;3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118)

為了對(duì)微小隱孢子蟲(chóng)(C.parvum)類鈣調(diào)蛋白(CML)基因進(jìn)行原核表達(dá)，分析重組表達(dá)蛋白的反應(yīng)原性。以C.parvum卵囊cDNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增得到C.parvumCML基因。將CML基因連接到克隆載體pMD18-T，獲得重組質(zhì)粒pMD-CML，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切后，連接到經(jīng)相同內(nèi)切酶酶切的表達(dá)載體pGEX-6p-1上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。利用GST親和樹(shù)脂法純化重組表達(dá)蛋白，對(duì)純化的重組蛋白進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果表明，成功構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-CML，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后成功地表達(dá)出了分子質(zhì)量約為51 ku的重組蛋白rCML，純化的蛋白rCML能與感染兔隱孢子蟲(chóng)(C.cuniculus)的兔血清發(fā)生特異性反應(yīng)，具有很好的反應(yīng)原性。

微小隱孢子蟲(chóng)；類鈣調(diào)蛋白基因；克?。辉吮磉_(dá)

隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidiumspp.)是一種細(xì)胞內(nèi)機(jī)會(huì)性致病原蟲(chóng)，廣泛寄生于包括哺乳類、禽類、爬行類和魚(yú)類動(dòng)物在內(nèi)的170多種物種。在已經(jīng)得到公認(rèn)的20余種隱孢子蟲(chóng)種中[1]，對(duì)嬰幼兒和免疫功能低下或缺陷者危害最大的是微小隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidiumparvum)。

鈣離子(Ca2+)作為一種重要的第二信使，可引起細(xì)胞內(nèi)多種特異性反應(yīng)應(yīng)答，參與多種細(xì)胞活動(dòng)。Ca2+要將信號(hào)傳遞下去，其下游的感受器是極其重要的。鈣調(diào)蛋白(calmodulin proteins, CaM)是廣泛存在于各種真核生物中的多功能蛋白，為Ca2+的受體蛋白，對(duì)生物體內(nèi)多種Ca2+依賴的細(xì)胞功能和酶體系都有重要的調(diào)節(jié)作用[2]。在弓形蟲(chóng)中，Ca2+/CaM基本上參與了包括弓形蟲(chóng)自身運(yùn)動(dòng)、黏附宿主細(xì)胞、穿透、內(nèi)在化、細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，甚至是由宿主細(xì)胞排出的全過(guò)程[3]。在微小隱孢子蟲(chóng)中，子孢子頂復(fù)器蛋白的釋放需要依靠蟲(chóng)體細(xì)胞骨架和胞內(nèi)Ca2+的參與，而子孢子頂復(fù)器蛋白的釋放會(huì)影響子孢子侵襲宿主細(xì)胞[4]。CaM存在于脊椎和無(wú)脊椎、原生動(dòng)物、植物各種組織的幾乎所有真核細(xì)胞內(nèi)。在脊椎動(dòng)物中，CaM一般由148個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為16.7 ku，其序列在不同物種間高度保守。從外形上看，CaM形似啞鈴，由兩端的球狀結(jié)構(gòu)以及連接二者的長(zhǎng)螺旋結(jié)構(gòu)組成，其中球狀的N末端和C末端分別由1對(duì)EF手性(EF-hands)構(gòu)成，是結(jié)合Ca2+的結(jié)構(gòu)域，因此，每個(gè)CaM都有4個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)[5]。類鈣調(diào)蛋白(calmodulin-like proteins, CML)與CaM具有相似的結(jié)構(gòu)，也具有EF-hands結(jié)構(gòu)域，研究CML對(duì)進(jìn)一步了解生物體的生命活動(dòng)機(jī)制具有重要意義。

在頂復(fù)門寄生蟲(chóng)中，對(duì)CML的研究報(bào)道很少，但在其他物種中有不少關(guān)于CML的報(bào)道。有文獻(xiàn)報(bào)道[6]，植物DNA病毒衛(wèi)星抑制RNA沉默需要宿主CML抑制依賴于RNA的RNA聚合酶6(RNA-dependent RNA polymerase 6, RDR6)的表達(dá)。在擬南芥中，CML43在根尖的正常生長(zhǎng)和植物免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著Ca2+信號(hào)器的作用[7]，而作為Ca2+信號(hào)器的CML39在促進(jìn)幼苗發(fā)育的光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[8]。上皮特異性人鈣調(diào)樣蛋白(epithelial-specific human calmodulin-like protein, CALML3)在良性口腔黏膜細(xì)胞中高表達(dá)，但當(dāng)口腔癌發(fā)生時(shí)，在浸潤(rùn)性癌細(xì)胞中CALML3的表達(dá)量呈顯著下調(diào)趨勢(shì)，這表明CALML3可能是口腔癌篩查新的敏感的標(biāo)志物[9]。

本試驗(yàn)克隆了微小隱孢子蟲(chóng)CML基因，首次構(gòu)建了其原核表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)與純化，為研究隱孢子蟲(chóng)CML蛋白的特性與功能，觀察其能否與Ca2+相互作用及作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、菌株、cDNA和血清 原核表達(dá)載體pGEX-6p-1由本實(shí)驗(yàn)室保存；克隆載體pMD18-T為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；大腸埃希菌DH5α和BL21(DE3)為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；微小隱孢子蟲(chóng)卵囊cDNA、感染兔隱孢子蟲(chóng)(C.cuniculus)的兔陽(yáng)性血清由本試驗(yàn)制備保存。

1.1.2 主要試劑 TaKaRa ExTaq、dNTP Mixture、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ、T4 DNA Ligase為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品；DNA Marker和蛋白Marker為Fermentas公司產(chǎn)品；胰蛋白胨、酵母提取物和脫脂奶粉為Oxoid公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小抽試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG-HRP為ImB公司產(chǎn)品；過(guò)硫酸銨、30%丙烯胺酰胺為Bio-Bad公司產(chǎn)品；TEMED、SDS為Sigma公司產(chǎn)品；PVDF為GE Healthcare公司產(chǎn)品；High-Affinity GST·BindTMKits為Novagen公司產(chǎn)品； 20% IPTG為上海浩然生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank登錄的微小隱孢子蟲(chóng)CML基因序列(登錄號(hào)EAK87541)和表達(dá)載體pGEX-6p-1的酶切位點(diǎn)特性，應(yīng)用Primer Premier 5.5軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物。在上游引物的5′端引入限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和保護(hù)性堿基序列，在下游引物的5′端引入限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和保護(hù)性堿基序列，其中上游引物CML F為:5′-CGCGGATCCATGTCAGAATCATCAAAT-3′(下劃線處為BamH Ⅰ酶切位點(diǎn))；下游引物CML R為：5′-CCGCTCGAGTTACTAATTGAGAAGAGGT-3′(下劃線處為XhoⅠ酶切位點(diǎn))。

1.2.2 CML基因的擴(kuò)增與克隆 以微小隱孢子蟲(chóng)卵囊cDNA為模板，利用CML F、CML R為引物擴(kuò)增CML基因，其反應(yīng)體系為：ddH2O 13 μL，10×PCR buffer(含Mg2+)2 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 2 μL，TaKaRa ExTaq0.5 μL 100 μmol/L的CML F和CML R各0.25 μL，cDNA模板2 μL，總體積20 μL。反應(yīng)條件為： 94 ℃ 8 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物用12 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，連接到克隆載體pMD18-T上，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。將經(jīng)菌液PCR初步鑒定為陽(yáng)性的克隆送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，鑒定正確后，提取重組質(zhì)粒，命名為pMD-CML。

1.2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 用BamH Ⅰ和XhoⅠ分別對(duì)pMD-CML重組質(zhì)粒和pGEX-6p-1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，利用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上，挑取單菌落，將經(jīng)PCR、BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切鑒定為陽(yáng)性的克隆送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。序列正確后，提取重組表達(dá)質(zhì)粒，命名為pGEX-CML。

1.2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 將重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-CML轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析。將表達(dá)菌超聲破碎后進(jìn)行離心，取上清，利用High-Affinity GST·BindTMKits進(jìn)行純化，用SDS-PAGE分析蛋白的純度。

1.2.5 重組蛋白的Western blot分析 將純化的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，采用半干轉(zhuǎn)印法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。經(jīng)50 g/L脫脂奶粉封閉后，以感染C.cuniculus的兔陽(yáng)性血清為一抗(1∶400)，以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗(1∶2 000稀釋)，對(duì)重組蛋白進(jìn)行Western blot分析。

2 結(jié)果

2.1 CML基因的擴(kuò)增

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在大小約為660 bp處有一特異性擴(kuò)增條帶(圖1)，與預(yù)期663 bp大小相符。

2.2 重組質(zhì)粒pMD-CML的鑒定

使用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ對(duì)重組質(zhì)粒pMD-CML進(jìn)行雙酶切，得到與預(yù)期大小相符的663 bp和2 692 bp片段(圖2)。將插入基因測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast搜索，結(jié)果顯示該序列與GenBank登錄的微小隱孢子蟲(chóng)Iowa type Ⅱ分離株CML基因序列的一致性為100%。

2.3 重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-CML的鑒定

使用BamH Ⅰ和XhoⅠ對(duì)重組質(zhì)粒pGEX-CML進(jìn)行雙酶切，得到大小分別為4 900 bp和663 bp的2條清晰的條帶(圖3)，與預(yù)期大小相符。序列測(cè)定結(jié)果顯示沒(méi)有發(fā)生堿基突變，且插入方向正確。

圖1 微小隱孢子蟲(chóng)CML基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of Cryptosporidium parvum CML gene

圖2 重組質(zhì)粒pMD-CML酶切產(chǎn)物的電泳鑒定Fig.2 The electrophoresis identification of recombinant plasmids pMD-CML digested with restriction enzymes

圖3 重組質(zhì)粒pGEX-CML酶切產(chǎn)物的電泳鑒定Fig.3 The electrophoresis identification of recombinant plasmids pGEX-CML digested with restriction enzymes

2.4 重組質(zhì)粒pGEX-CML的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的純化

重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-CML轉(zhuǎn)化菌經(jīng)濃度為1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)6株pGEX-CML轉(zhuǎn)化菌均高效表達(dá)出了重組CML蛋白(recombinant CML, rCML)，大小約為51 ku，不同菌株間的表達(dá)量差別不大；表達(dá)時(shí)相結(jié)果表明重組質(zhì)粒pGEX-CML轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)表達(dá)超過(guò)6 h后，重組蛋白表達(dá)量幾乎不再增加；表達(dá)形式檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明，重組蛋白rCML以可溶性和包涵體兩種形式存在(圖4)；表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)High-Affinity GST·Bind Resin純化后，得到了較純的重組蛋白rCML(圖4)。

圖4 重組質(zhì)粒pGEX-CML轉(zhuǎn)化菌表達(dá)及純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of pGEX-CML transformed bacteria expression products and purified recombinant CML proteins

2.5 重組蛋白rCML的Western blot分析

Western blot 結(jié)果顯示，在分子質(zhì)量約為51 ku的位置出現(xiàn)一個(gè)條帶，而IPTG誘導(dǎo)的pGEX-6p-1轉(zhuǎn)化菌在此位置沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)條帶(圖5)，表明純化的目的蛋白能被感染C.cuniculus的兔血清特異性識(shí)別。

圖5 純化重組蛋白的Western blot分析Fig.5 Western blot analysis of purified recombinant CML protein

3 討論

Ca2+在頂復(fù)門寄生蟲(chóng)的移行、侵襲和調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。有研究證明，CaM可與惡性瘧原蟲(chóng)蛋白激酶B(Plasmodiumfalciparumprotein kinase B，PfPKB)的N端發(fā)生相互作用，進(jìn)而提高依賴磷酸化的激活作用，而胞內(nèi)的Ca2+對(duì)Ca2+/calmodulin-PfPKB信號(hào)通路的激活是必要的，且能被蟲(chóng)體內(nèi)儲(chǔ)存的磷脂酶C(phospholipase C)所調(diào)節(jié)，最終，CaM與Ca2+在惡性瘧原蟲(chóng)侵襲細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[10]。而關(guān)于微小隱孢子蟲(chóng)CML的報(bào)道很少，其特性和功能并不清楚，但它具有EF-hands結(jié)構(gòu)域，具備與CaM相似的結(jié)構(gòu)[11]。要研究CML的特性和功能，觀察其能否與Ca2+結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種反應(yīng)，需要對(duì)CML基因進(jìn)行體外表達(dá)，因此，開(kāi)展微小隱孢子蟲(chóng)CML基因的原核表達(dá)和重組蛋白的純化是一項(xiàng)基礎(chǔ)性工作，具有重要意義。

要獲得具有表達(dá)水平高、可溶性表達(dá)和易于純化的蛋白產(chǎn)物，選擇一個(gè)合適的表達(dá)系統(tǒng)是很重要的環(huán)節(jié)?；虻谋磉_(dá)系統(tǒng)主要包括真核和原核兩大系統(tǒng)，但真核表達(dá)系統(tǒng)具有目的蛋白的表達(dá)水平低、費(fèi)用高、周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)[12]，所以本文選擇原核表達(dá)系統(tǒng)，而原核表達(dá)系統(tǒng)主要為大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)。

本試驗(yàn)采用pGEX-6p-1原核表達(dá)載體，它是一個(gè)高效表達(dá)載體，且該載體表達(dá)的重組蛋白含有GST[13]，為后期使用High-Affinity GST·BindTMKits進(jìn)行純化提供了方便，然后通過(guò)構(gòu)建pGEX-CML原核表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，使用終濃度為1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析表明，轉(zhuǎn)化菌裂解產(chǎn)物的上清和沉淀都出現(xiàn)了明顯區(qū)別于未誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化菌裂解物和誘導(dǎo)的空載體轉(zhuǎn)化菌裂解物的蛋白條帶，且上清和沉淀中的目的蛋白表達(dá)量都很大。由于上清中的目的蛋白是以可溶形式存在，有利于純化，預(yù)期蛋白具有活性的可能較大，便于后續(xù)開(kāi)展rCML與Ca2+相互作用研究，所以本試驗(yàn)選用了上清中的重組蛋白。經(jīng)High-Affinity GST·Resin 親和層析法對(duì)可溶表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行純化，Western blot分析顯示純化的融合蛋白能被兔抗C.cuniculus血清識(shí)別，在分子質(zhì)量約為51 ku處出現(xiàn)反應(yīng)條帶，與預(yù)期大小一致，而陰性對(duì)照沒(méi)有相同的條帶，表明rCML具有良好的反應(yīng)原性，為下一步研究微小隱孢子蟲(chóng)CML的特性與功能，利用該蛋白及其編碼基因開(kāi)展隱孢子蟲(chóng)病的預(yù)防和治療研究提供了基礎(chǔ)。

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Cloning and Prokaryotic Expression ofC.parvumCalmodulin-like Protein Gene

YANG Xiao-jiao1,ZHOU Peng1,MI Rong-sheng1,HUANG Yan1,SHI Kai1,2,WANG Xiao-juan1,3,WANG Xiang-pei1,3,LIU Yu-xuan1,LEI Xiao-si1,2,CHEN Zhao-guo1

(1.LaboratoryofQualityandSafetyRiskAssessmentforAnimalProducts(Shanghai),MinistryofAgriculture,KeyLaboratoryofAnimalParasitology,MinistryofAgriculture,ShanghaiVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Shanghai,200241,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Ya'an,Sichuan,625014,China; 3.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin,130118,China)

In order to expressCryptosporidiumparvumcalmodulin-like protein (CML) gene inE.coliBL21(DE3) and analyze the antigenicity of the recombinant protein, CML gene was amplified by PCR with cDNA ofC.parvumoocysts. The amplified CML gene was cloned into pMD18-T vector and the DNA of recombinant pMD-CML plasmid was extracted. The plasmid was digested with double enzymes and the objective fragments were connected with pGEX-6p-1 which had been digested with same enzymes. After identifying by double restrict enzyme digestion and gene sequence analysis, the recombinant plasmids were transformed toE.coliBL21(DE3) cells and the transformed bacteria was induced to express with IPTG. Recombinant proteins were purified by High-Affinity GST·Bind Resin affinity chromatography. Antigenicity of the recombinant proteins was analyzed by Western blot. The results showed that the prokaryotic expression vector pGEX-CML was constructed successfully and an approximate 51 ku recombinant protein rCML was expressed successfully after inducing with IPTG. The purified recombinant protein could be recognized specifically by the sera from rabbit infected withC.cuniculus.

Cryptosporidiumparvum；calmodulin-like protein gene;cloning;prokaryotic expression

2014-05-03

國(guó)家科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目(2012ZX10004220)；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2013JB13)；家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金課題(SKLVEB2013KFKT017)；上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目[滬農(nóng)科攻字(2005)第3-4號(hào)]

楊曉嬌(1987-)，女，河南夏邑人，碩士研究生，主要從事寄生蟲(chóng)分子生物學(xué)研究。*

S852.723；Q785

:A

:1007-5038(2015)01-0026-05