朱涵明月 李西 朱天輝

(四川農業(yè)大學，成都，611130)

責任編輯:程 紅。

藍花楹(Jacaranda acutifolia Humb．et Bonpl．)隸屬于雙子葉植物綱(Magnoliopsida)、唇形目(Lamiales)、紫葳科(Bignoniaceae)、藍花楹屬(Jacaranda)，別名含羞草葉藍花楹、尖葉藍花楹、藍霧樹［1-2］。由于藍花楹樹形酷似鳳凰木，屬稀有的藍紫色系和冷色系高大喬木，春末秋初開花之時葉落盡，藍紫色碩大的花朵錦簇綴滿枝頭蔚為壯觀，因而被定義為一種極具開發(fā)前景的園林觀賞植物［3-4］。藍花楹起源于阿根廷、玻利維亞、巴西等地區(qū)，近些年在我國的海南、福建、廣西、廣東、云南、四川等地均有引種和栽培［5］。目前，國內外對藍花楹的研究主要集中在組織培養(yǎng)與快速繁殖［6］、花器官特征觀察［7］、生態(tài)學特性研究［8］及種子萌發(fā)與幼苗生長營養(yǎng)物質［9］等方面，而對于藍花楹病害的報道仍處于空白。2014年3月，筆者于四川省西昌市藍花楹栽培區(qū)內首次發(fā)現(xiàn)1種為害藍花楹寄主植株莖干基部的新病害——藍花楹莖腐病。侵染部位發(fā)生在根莖處，莖部皮層組織及木質部的腐爛可導致整株植株的死亡，嚴重威脅著該物種的經濟效益和觀賞價值。為此，筆者通過固定標準地連續(xù)定點觀察并對發(fā)病植株病原菌進行分離和致病性測定，結合形態(tài)學及rDNA-ITS序列分析確定其病原菌種類、研究其系統(tǒng)發(fā)育，以期為藍花楹莖腐病的有效防治奠定理論基礎，同時為藍花楹新病害的研究提供參考。

1 材料與方法

1．1 藍花楹莖腐病病害調查

自2014年3月中旬起，在固定樣方內，采用隨機抽樣的方法，分別對四川省西昌市3個藍花楹栽培園區(qū)內的3～5年生藍花楹莖腐病病害為害癥狀、感病指數進行調查、記錄，每栽培園區(qū)內隨機選取30株。根據實際感病情況，將栽培園區(qū)內藍花楹發(fā)生莖腐病的病害程度分為5級:0級，植株生長健康，莖干生長正常，莖干及根部均未變色;Ⅰ級，莖干主體生長正常，基部部分發(fā)生變色，變色面積為0～25%;Ⅱ級，莖干輕微變色，但仍正常生長，莖干基部變色面積為＞25%～50%;Ⅲ級，莖干基部變色明顯，變色面積為＞50%～75%;Ⅳ級，莖干基部幾乎全部變色，莖基部皮層組織出現(xiàn)變軟、開裂現(xiàn)象，變色面積為＞75%～100%;V級，莖干基部全部變色，面積達到100%，根部腐爛，植株枯萎，死亡。根據感病指數公式計算園區(qū)內藍花楹莖腐病病害發(fā)生情況的感病指數。

感病指數=(∑(病級株數×相對應代表數值)/(株數總和×發(fā)病最重的代表數值))×100。

1．2 病樣采集及病原菌分離、純化、培養(yǎng)

隨機選取藍花楹栽培園區(qū)內不同發(fā)病程度的莖腐病植株10株。每株截取莖干基部距離土層10～50 cm處圓柱體枝干，裝入無菌袋內帶回實驗室，于冰箱內4℃保存，等待病原菌的分離、培養(yǎng)試驗。用已滅菌鑷子和無菌棉簽擦除枝干表面雜物，然后采用病原菌常規(guī)組織分離法進行藍花楹莖腐病病原菌的分離，單孢純化，具體參照韓永超等［10］的方法。對初步分離得到的菌株按照形態(tài)學特性進行粗略歸類，編號，純化培養(yǎng)。

1．3 病原菌致病性測定

將分離得到的具有顯著優(yōu)勢的菌株單獨接種到已配制好的馬鈴薯瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h后用無菌水洗下。結合冷懷瓊等［11］確定的產孢條件，在25℃、pH=7、黑暗與光照交替處理條件下連續(xù)培養(yǎng)5～7 d，收集分生孢子，用無菌水稀釋成3×104菌落·mL-1，制成病原菌孢子懸浮液。取孢懸液100 mL，采用刺傷枝干法，均勻的涂抹于室內盆栽2年生藍花楹刺傷莖干基部(75%酒精表面消毒，無菌水沖洗3～5次)，同時以只涂抹無菌水植株作為空白對照，每試驗3組重復。15 d后觀察莖干基部感病情況，與自然發(fā)病莖干比較后，對感病植株莖基部再次進行病原菌的分離，并與1．2分離得到的優(yōu)勢菌株進行形態(tài)學比較分析。

1．4 病原菌鑒定

1．4．1 形態(tài)學鑒定

將致病性檢測篩選出的優(yōu)勢菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，25℃、pH=7，黑暗與光照交替處理條件下連續(xù)培養(yǎng)5～7 d后觀察菌落培養(yǎng)性狀，并參照李婕等的方法［12］進行病原菌的肉眼及顯微形態(tài)學觀察。根據病菌生長速度、菌落形態(tài)特征和產孢特性查閱真菌分類鑒定手冊，確定病原菌種類。

1．4．2 分子生物學鑒定床震蕩

DN培A養(yǎng)的 的提 方取 法:優(yōu)，具勢菌體株參菌照絲王的風提芹取等采［13］用的液方體法搖，略有改動。分別接種菌株于PDA培養(yǎng)基上，室溫下連續(xù)培養(yǎng)5 d后，取菌落邊緣菌絲少許，轉接于瓶裝量℃為、pH 40= m7，L1的2 5 P r·DB mi液n-體1條培件養(yǎng)下錐震形蕩瓶培(1養(yǎng)0 05 m～L7) d中。，將2 5無菌水沖洗、紗布過濾后收集到的菌絲置于-20℃條件下保存、備用。基因組DNA的提取主要參照天根植物基因組DNA提取試劑盒的操作步驟，具體可參照韓振云等的方法［14］。

PCR擴增:rDNA片段的擴增引物選擇由上海生工技術公司合成的真菌通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。反應擴增體系(20μL)包括，基因組DNA(1．0μL)，10×PCR buffer(2．0μL)，dNTP(0．25 mmol·L-1，1．0μL)，r Taq(5 U·uL-1，0．2 μL)，Primer1(1μmol·L-1，0．5μL)，Primer2(1μmol·L-1，0．5μL)，ddH2O(14．8μL)。反應程序為96℃預變性5min;進入循環(huán)，94℃變性30 s，52℃退火30s，72℃延伸1 min，30個循環(huán);72℃延伸10 min。4℃保存。PCR產物的檢測在1．5%瓊脂糖凝膠電泳上進行。

產物的回收、克隆、測序:參照林劍偉等［15］的試驗，利用回收試劑盒對目標基因片段進行切膠、回收、純化。將回收得到的DNA通過與T載體(pMD18-T)的連接后轉入到感受態(tài)大腸桿菌內，最后選取陽性克隆產物送至深圳華大生物公司進行測序。

1．4．3 病原菌基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

根據生物公司發(fā)回的片段序列，登陸NCBI進行Blast比對，從GeneBank中下載同源性較高菌株的rDNA-ITS序列，利用MEGA 5．0建立病原菌菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，進行基于rDNA-ITS的序列分析。

1．5 數據處理

利用Microsoft Excel和SPSS18．0進行ANOVA分析。

2 結果與分析

2．1 藍花楹莖腐病病害癥狀及危害程度

調查結果顯示，藍花楹莖腐病主要為害3～5年生藍花楹幼年植株，幼林群體發(fā)病率占全部感病植株的80%，為總調查數量的30%;春季3—4月份為藍花楹莖腐病的發(fā)病初期，5—7月份進入發(fā)病盛行期，受到病原菌侵染的植株初期枝干莖基部呈灰褐色，繼而轉化為深褐色，同時植株葉片出現(xiàn)變黃、干枯、脫落的現(xiàn)象;隨著感病程度的增加，嚴重受害部位會有褐色液體流出，莖基部皮層組織出現(xiàn)變軟、開裂、甚至腐爛等癥狀;病害由莖干基部順勢向下縱向蔓延，甚至可擴展至藍花楹根部，導致根部皮層組織及木質部的腐爛，從而使得整株植株死亡(圖1)。

結合藍花楹莖腐病病害分級標準，調查結果表明，5個病害等級均有不同程度的發(fā)生(表1)，其中以1、2等級發(fā)生較為普遍，3、4、5等級較少，雖然健康植株所占比例較高，達到44．44%，但各等級感病指數總計達到25．32%。由此可知，該栽培園區(qū)內藍花楹莖腐病的發(fā)生較為嚴重，且發(fā)病程度與藍花楹的齡級結構有關。

圖1 藍花楹莖腐病癥狀

表1 藍花楹莖腐病侵染指數

2．2 優(yōu)勢病原菌種群

從野外采集的發(fā)病莖干基部共取面積1 cm×1 cm的分離組織樣品100塊，通過常規(guī)組織分離和PDA平板培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)得到真菌48株，其中優(yōu)勢菌群有兩類共39株，占分離菌株總數的81．25%，其余雜菌僅占18．75%。兩類優(yōu)勢菌群形態(tài)學差異顯著，但均具有典型鐮刀菌屬真菌的菌落特征，分別編號為A1、B1。A1類群培養(yǎng)7 d后菌落呈現(xiàn)紅紫色，B1菌落則近白色。從雜菌中篩選出6株形態(tài)學有明顯差異的菌株純化培養(yǎng)后，分別編號為C1、D1、E1、F1、G1、H1。藍花楹莖腐病病原菌的分離過程中未見細菌、放線菌及其他霉菌菌落。

2．3 優(yōu)勢菌致病性

利用2．2中純化得到的8種菌株的孢子懸浮液進行致病性測定。結果表明:僅A1和B1菌株在刺傷接種條件下能夠使藍花楹2年生盆栽幼苗莖干基部感病，且二者分別接種15 d后植株莖干基部均出現(xiàn)灰褐色至褐色不同程度病斑，莖干皮層組織變軟、少量部分甚至表現(xiàn)出腐爛癥狀，與野外調查時藍花楹莖腐病的病癥完全一致;而其余6種菌株均不能影響藍花楹幼苗的生長，說明這6株雜菌不是藍花楹莖腐病的致病菌。此外，將A1與B1同時利用刺傷接種法接種于健康藍花楹幼苗莖干，15 d后發(fā)現(xiàn)被接種的藍花楹莖干基部均出現(xiàn)不同程度的變色、開裂、變軟、流出褐色液體現(xiàn)象，甚至部分植株根部出現(xiàn)嚴重腐爛的癥狀。分別對單獨接種A1、B1的感病植株和同時接種A1、B1的發(fā)病組織進行再分離試驗得到與原接種菌株形態(tài)一致的分離菌株，從而證明A1與B1均是藍花楹莖腐病的病原菌，且二者共同作用下致病性更強。

2．4 病原菌形態(tài)學特性

將擬確定的病原菌A1、B1接種到含PDA的平板上，25℃、pH=7條件下培養(yǎng)5～7 d后，觀察到A1菌落初期菌絲濃密乳白色，后隨著培養(yǎng)時間的增加逐漸變?yōu)榉郯咨?、淺粉色、肉色，最后略帶紫色(圖2A-B)。菌落圓形，氣生菌絲高3～5 mm，顯微鏡下觀察，可看到無色鐮刀形大型分生孢子，兩端稍尖，中間略彎曲(圖2C)，基部細胞花柄狀，小分生孢子，倒卵形，一般無隔;B1菌落中央形成明顯凸起狀，菌落表面呈白色，密生氣生菌絲棉絮狀，菌落背面黃綠色(圖2D-E)，在顯微鏡下可觀察到鐮刀形大型、有隔(一般為3～5個)分生孢子，菌絲頂端或菌絲中間生長出球形厚垣孢子(圖2F-G)，培養(yǎng)初期菌絲為白色，后期菌落背面產生黃色色素，產生大小兩類分生孢子，分別呈卵圓形(0～1個隔)和馬特型(多為3個分隔，微彎曲)。結合真菌形態(tài)學分類鑒定手冊初步判斷A1和B1分別為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)和厚垣鐮刀菌(Fusarium chlamydosporum)。

圖2 A1、B1菌落、分生孢子及菌絲顯微形態(tài)

2．5 病原菌分子生物學

在依據形態(tài)學鑒定的基礎上，利用真菌通用引物ITS1和ITS4分別對A1、B1菌株進行基于rDNAITS序列的分子生物學鑒定。在1．5%瓊脂糖凝膠電泳檢測下，得到2條清晰的500 bp大小的基因片段(圖3)，且該片段無拖尾現(xiàn)象，表明DNA純度較高，未被污染，可滿足后續(xù)測序要求。

利用回收試劑盒對目標基因片段進行切膠、回收、純化，再將回收得到的A1、B1的DNA分別與T載體(pMD18-T)連接，轉入到感受態(tài)大腸桿菌內，均得到白色菌落。挑取白色菌斑克隆，PCR擴增，檢測到多個藍色斑點，即克隆成功且均包含目的基因片段(圖4)。

圖3 尖孢鐮刀菌和厚垣鐮刀菌電泳結果

選取陽性克隆成功的菌株經深圳華大生物公司測序分別得到A1、B1兩條大小為516、523 bp的序列。根據生物公司發(fā)回的片段序列，分別與上傳至 NCBI的序列進行基于ITS序列的同源性分析。

圖4 A1、B1菌株克隆產物

2．6 病原菌系統(tǒng)發(fā)育分析

對A1、B1菌株進行同源性ITS序列的Blast比對，發(fā)現(xiàn)菌株A1、B1分別與F．oxysporum和F．chlamydosporum菌株同源性達到99%，其代表性同源性較高序列登錄號分別是JF807396．1和EU653293．1，因此判斷A1、B1菌株分別為F．oxysporum和F．chlamydosporum。從GeneBank中下載同源性較高菌株的rDNA-ITS序列，利用MEGA 5．0建立菌株A1、B1的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)，進行基于rDNA-ITS的序列分析。

圖5 基于rDNA-ITS的A1、B1菌株與相關菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結論與討論

藍花楹是一種有較高觀賞價值的園林植物，但近年來在四川栽培區(qū)出現(xiàn)較大面積整株死亡的現(xiàn)象，筆者通過固定樣方定期定點觀察，發(fā)現(xiàn)1種新病害——藍花楹莖腐病。經病株采樣、分離、單孢培養(yǎng)及致病性測定，得到2株具有代表性的菌株A1和B1，對其形態(tài)學特征進行觀察初步判斷二者分別為F．oxysporum和F．chlamydosporum。試驗中得到的A1形態(tài)學特性與Li［16］、Lops［17］、García-Bastidas［18］等研究中對尖孢鐮刀菌形態(tài)學特性描述相一致，而B1形態(tài)學特性則與Lazreg等［19-20］和Lazarotto等［21］的研究結論相同，因此基于形態(tài)學特性初步對二者的分類地位做出判斷。由于分子生物學技術鑒定菌株分類具有快速、準確、易操作的特點［22］，所以本試驗采用傳統(tǒng)鑒定手段與分子生物學相結合的方式，通過登陸NCBI進行Blast比對，建立同源性較高的Fusarium屬菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，最終確定菌株A1和B1分別為F．oxysporum和F．chlamydosporum，且分子鑒定與形態(tài)學鑒定結果一致，這為鑒定結果的準確性提供了重要基礎保障。

致病性測定試驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)．oxysporum與F．chlamydosporum單獨接種于被刺傷的藍花楹盆栽幼苗一段時間后均可引起與野外自然發(fā)病相同的癥狀，二者同時接種時癥狀更為明顯，說明F．oxysporum和F．chlamydosporum均是藍花楹莖腐病的病原菌，且二者具有協(xié)同增效的作用，共同導致藍花楹莖腐病的發(fā)生。目前，國內外對于F．oxysporum引起多種真菌性植株根腐病害的研究報道較多，如黃芪根腐病［23］、燈盞花根腐?。?4］、蟹爪蘭根腐病［17］等，但是國內暫無有關F．chlamydosporum可引起寄主植株根腐病的報道，在國外僅在辣椒［25］和地中海白松［20］等少數寄主上有過報道，所以本研究所報道的F．oxysporum與F．chlamydosporum可作為引起藍花楹莖腐病的新病原，但二者是否為復合侵染，特別是F．chlamydosporum如何對藍花楹造成莖腐病的作用機制尚不清楚，有待于更深入研究。

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