朱琳 黃建 陳天陽 周永斌

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，沈陽，110866) (西北農(nóng)林科技大學(xué)) (沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué))

責(zé)任編輯:程 紅。

生物質(zhì)能源開發(fā)是國家重要的戰(zhàn)略任務(wù)。近年來生物質(zhì)能源木本樹種的栽培與育種工作逐步得到重視。文冠果(Xanthoceras sorbifolia Bunge)屬無患子科文冠果屬，落葉灌木或小喬木，文冠果種仁含油量高達(dá)55%～66%，是我國特有的珍稀木本油料樹種，具有生物質(zhì)能源開發(fā)潛力。文冠果廣泛分布于我國北方各?。?-2］，經(jīng)營模式以純林為主。近年來發(fā)現(xiàn)，遼西地區(qū)干旱的氣候條件及純林帶來的土壤肥力退化等諸多問題制約了文冠果林的可持續(xù)發(fā)展。

土壤微生物在生態(tài)系統(tǒng)中有著重要作用，土壤微生物推動(dòng)土壤有機(jī)質(zhì)與土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和循環(huán)，間接影響植物的分布和變化進(jìn)而影響到經(jīng)濟(jì)林地的產(chǎn)量效益［3-5］。其中，與植物根系共生的菌根真菌就與植物的生長有著密切的聯(lián)系，在根際土壤中菌根真菌不但可以影響細(xì)菌群落分布、分解有機(jī)質(zhì)、改良土壤結(jié)構(gòu)、提高土壤肥力，而且可以有效控制植物病蟲害、分解土壤中的有毒物質(zhì)［6-9］。相關(guān)研究表明，在不同生境中菌根真菌對不同的植物有著特異的選擇偏好性，甚至在同一生境也差異顯著［10］。許多菌根真菌及根內(nèi)真菌與特定范圍內(nèi)的宿主植物形成共生體系，進(jìn)而導(dǎo)致森林群落動(dòng)態(tài)的變化［11］。探究隨林木的生長發(fā)育，植物和菌根形成的共生體系與真菌種群結(jié)構(gòu)之間的變化關(guān)系，以及對其他生物群落遺傳多樣性的影響等。對了解相關(guān)林地真菌群落結(jié)構(gòu)的組成及其群落多樣性具有重要的生態(tài)學(xué)意義。

隨著核酸測序的快速發(fā)展，尤其是下一代測序技術(shù)的出現(xiàn)，拓展了人們對環(huán)境微生物的認(rèn)識，使其成為對難培養(yǎng)微生物或不可培養(yǎng)微生物群落研究的技術(shù)策略，能夠讓人們直接從環(huán)境中獲取總DNA，并對其進(jìn)行測序分析［12］，從整體水平上盡可能揭示根際真菌的群落結(jié)構(gòu)及多樣性。本研究以遼寧省阜新市不同林齡文冠果人工林為研究對象，以Illumina MiSeq為測序平臺，分析不同發(fā)育階段的文冠果根際土壤/根系真菌群落結(jié)構(gòu)，從群落角度研究文冠果根系內(nèi)生真菌與根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的變化，全面了解真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性與土壤養(yǎng)分變化之間的關(guān)系，為文冠果人工林可持續(xù)經(jīng)營管理提供理論依據(jù)。

1 研究區(qū)概況

文冠果人工林樣地位于遼寧省阜新市(東經(jīng)121°01'～122°55'，北緯41°41'～42°56')，屬北溫帶大陸性季風(fēng)氣候區(qū)。年平均降水490 mm，主要集中在7—8月份，地面蒸發(fā)量達(dá)2 100 mm，屬半干旱地區(qū)。年平均氣溫6．8℃，相對濕度50%～70%，年日照時(shí)數(shù)2850～2950 h，無霜期154 d;土壤類型以風(fēng)沙土為主，部分為褐土，土層厚度為35～50 cm。

2 材料與方法

2．1 樣地選擇

選擇立地條件、撫育管理基本一致的3個(gè)林齡階段的文冠果人工林作為樣地。樣地基本概況見表1。

表1 遼寧省阜新市文冠果人工林樣地基本概況

2．2 土樣采集

2014年8—9月采集。按照蛇形采樣法，在文冠果根際周圍0～30 cm深土壤中采集樣品30個(gè)，每個(gè)土樣約200 mL;同時(shí)，采集帶有完整毛細(xì)根系的根樣各30個(gè)。采集的土壤樣品過篩(＞4 mm)去除雜物和石塊［13］，放于塑封袋內(nèi)封口并編號置于-80℃保存。同時(shí)，將帶回的土樣取一半室內(nèi)自然風(fēng)干，研磨過100目篩后用于土壤理化分析。

2．3 土壤理化性質(zhì)測定

土壤含水量采用烘干法測定［14］。土壤全效氮采用開氏消煮法測定［15］。堿解氮采用堿解擴(kuò)散法測定［16］。全磷采用酸溶-鉬銻抗比色法測定。速效磷采用碳酸氫鈉法進(jìn)行測定。有機(jī)質(zhì)采用水合熱重鉻酸鉀-硫酸比色法測定［17］。

2．4 DNA提取、PCR擴(kuò)增及文庫的構(gòu)建

使用土壤DNA提取試劑盒(MEGA Soil DNA Kit，OmegaBiotekTM，USA)提取土壤的總DNA，將來自同一樣地的6個(gè)DNA樣品隨機(jī)合并，得到5個(gè)土壤DNA混合樣/樣地，對樣本進(jìn)行編號(S1-S5)/S2、(T1-T5)/S5、(D1-D5)/S10。將來自同一樣地的植物根系樣品隨機(jī)15個(gè)等量混合，得到2根系混合樣品/樣地，對樣本進(jìn)行編號(s1-s2)/S2、(t1-t2)/S5、(d1-d2)/S10，隨后使用試劑盒(Plant Genomic DNA Kit，天根，中國)提取DNA樣本。提取的DNA質(zhì)量和濃度采用Spectrophotometry分光光度計(jì)(熱電公司，美國)進(jìn)行濃度及純度檢測，用0．8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品的完整性，電壓120 V，電泳時(shí)間約為20 min［18］。

針對真菌核糖體基因間隔區(qū)的第一區(qū)(ITS1)，采用真菌特異引物對ITS1F(5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3')/ITS2R(5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為1．5 mmol·L-1MgCl2，0．4 mL dNTPs，1U Taq DNA重組聚合酶(Q5 GC high Enhancer)。PCR反應(yīng)在AB 9700熱循環(huán)儀(Applied Biosystems Inc．，F(xiàn)oster City，CA，USA)內(nèi)進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)?98℃預(yù)變性30 s;98℃變性30 s，57℃退火40 s，72℃延伸30 s，一共27次循環(huán);最后72℃終延伸5 min結(jié)束。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將目標(biāo)條帶進(jìn)行割膠回收，使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行純化。

利用BioTek酶標(biāo)儀將純化獲得PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量，參照Illumina文庫構(gòu)建試劑盒(Illumina?TruSeqTMDNA Sample Preparation Kit)指南進(jìn)行文庫的構(gòu)建，將建好的DNA文庫均一化至10 nmol·L-1后等體積混合。將混合好的文庫(10n http://www．vip．com/detail-372880-48367416．html)稀釋定量至4～5 pmol·L-1，再在Illumina MiSeq(Illumina Inc．，San Diego，CA)平臺進(jìn)行測序。

2．5 原始數(shù)據(jù)整理、過濾及優(yōu)質(zhì)序列獲取

首先對獲得的原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，即對雙端的序列做質(zhì)量過濾(堿基平均質(zhì)量≥Q20(即堿基準(zhǔn)確率為99%)，序列長度≥150 bp，且不容許有N)，利用軟件Flash(http://www．genomics．jhu．edu/software/FLASH/index．shtml)對通過質(zhì)量過濾的序列進(jìn)行連接，要求兩端序列(read1和read2)的overlap≥10 bp，且不容許堿基錯(cuò)配。最后，根據(jù)序列標(biāo)簽提取每個(gè)樣品的有效序列［18-19］。

因?yàn)楦咄繙y序建庫過程中的PCR擴(kuò)增易產(chǎn)生嵌合體序列以及點(diǎn)突變等系統(tǒng)錯(cuò)誤，所以需要對有效序列進(jìn)行進(jìn)一步過濾和去除嵌合體處理，本研究使用mothur(version 1．31．2，http://www．mothur．org/)軟件中uchime的方法去除嵌合體序列。

2．6 統(tǒng)計(jì)分析

利用Qiime調(diào)用uclust德爾方法［20］對優(yōu)質(zhì)序列按相似度≥97%進(jìn)行OTU的聚類，選取每個(gè)類最長的序列為代表序列。然后調(diào)用RDP-classifier［21］的方法，以RDP數(shù)據(jù)庫的序列為訓(xùn)練集對OTU代表序列進(jìn)行注釋，最終得到每個(gè)OTU分類學(xué)信息。利用Qiime軟件對所有序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣，以抽取到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線。同時(shí)計(jì)算各個(gè)林齡文冠果林的真菌群落豐富度指數(shù)chao1［22］、多樣性指數(shù)Simpson指數(shù)［23］和Shannon指數(shù)［24］。利用Qiime軟件的unifrac分析不同樣品間的距離矩陣，進(jìn)行PCoA真菌群落主成分分析。方差分析等數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析在SPSS軟件中處理［23］。

3 結(jié)果與分析

3．1 不同林齡的文冠果林地土壤性質(zhì)

由表2可以看出，該地區(qū)土壤養(yǎng)分含量普遍偏低。S2林地含水量較高。各樣地根際土壤有效磷含量指標(biāo)差異顯著，隨林木生長逐年降低，其中S2林地的有效磷(5．18 mg·kg-1)和全磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0．23 g·kg-1)均最高。

表2 文冠果人工林樣地根際土壤養(yǎng)分特征

3．2 測序結(jié)果

根據(jù)高通量測序結(jié)果對序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，測序共獲得clean reads有238．8104萬個(gè)(土壤209．2113萬個(gè)，根系295．991 0萬個(gè))，15個(gè)土壤樣本共獲得優(yōu)質(zhì)序列1 198 791條，6個(gè)植物樣本共獲得優(yōu)質(zhì)序列180 990條(表3)。樣地內(nèi)土壤和植物樣本的優(yōu)質(zhì)序列長度分布見表4，其中堿基數(shù)大于250 bp的獲得優(yōu)質(zhì)序列696 422條，堿基數(shù)在230～250 bp的共獲得優(yōu)質(zhì)序列696 422條，S2、S5、S10樣地內(nèi)土壤和植物樣本的優(yōu)質(zhì)序列分別為490 230、488 397、401 154條。

表3 文冠果人工林根系及土壤樣品序列

表4 優(yōu)質(zhì)序列長度分布

基于97%的相似度水平，共獲得1 115個(gè)OTUs。利用reads vs．OTUs稀釋曲線來評估樣本的測序數(shù)據(jù)量是否足夠［25］。從稀釋曲線(圖1)可以看出，21個(gè)樣本的稀釋曲線均趨于平緩，說明測序趨于飽和，測得的數(shù)據(jù)可以反映土壤及植物根內(nèi)真菌群落的真實(shí)情況。

3．3 土壤與根內(nèi)共生真菌群落組成

所有樣品中，共獲得1115個(gè)OTU的代表序列705 990條。其中，在門水平上441 243條，占總數(shù)的62．5%;在綱水平上427 829條，占總數(shù)的60．6%;在目水平上398 178條，占總數(shù)的56．4%;在科水平上355 112條，占總數(shù)的50．3%。其中，在門水平上子，囊菌門(Ascomycota)占總數(shù)的56．2%，擔(dān)子菌門(Basidiomycota)占總數(shù)的4．0%;在目水平上，肉座菌目(Hypocreales)占總數(shù)的19．7%，格孢菌目(Pleosporales)占總數(shù)的13．6%。文冠果根系及土壤樣本具體目分類水平上真菌菌株OTUs可見表5。在科水平上，叢赤殼科(Nectriaceae)占總數(shù)的14．3%，發(fā)菌科(Trichocomaceae)占總數(shù)的8．6%。

文冠果根際土壤真菌(S2+S5+S10)共獲得1 028個(gè)OTUs代表序列525 000條，子囊菌門占總數(shù)的45．3%、擔(dān)子菌門占總數(shù)的21．8%、壺菌門(Chytridiomycota)占總數(shù)的3．50%、接合菌門(Zygomycota)占全部總數(shù)的2．72%。其中，子囊菌門內(nèi)糞殼菌綱(Sordariomycetes)占總數(shù)的24．4%，座囊菌綱(Dothideomycetes)占總數(shù)的16．4%，散囊菌綱(Eurotiomycetes)占總數(shù)的8．7%，錘舌菌綱(Leotiomycetes)占總數(shù)的2．4%，盤菌綱(Pezizomycetes)占總數(shù)的0．3%，茶漬綱(Lecanoromycetes)占總數(shù)的0．2%。在擔(dān)子菌門，銀耳綱(Tremellomycetes)占總數(shù)的3．4%，傘菌綱(Agaricomycetes)占總數(shù)的0．4%，囊擔(dān)子菌綱(Cystobasidiomycetes)占總數(shù)的0．1%，微球黑粉菌綱(Microbotryomycetes)占總數(shù)的0．1%。

圖1 文冠果人工林細(xì)根以及根際土壤真菌OTUs稀釋曲線

對測序結(jié)果統(tǒng)計(jì)，根內(nèi)真菌(R2+R5+R10)共獲得514個(gè)OTUs，代表序列180 990條，子囊菌門占總數(shù)的27%、擔(dān)子菌門占總數(shù)的7．5%、接合菌門占總數(shù)的0．1%等。在綱水平上，座囊菌綱占總數(shù)的26%、糞殼菌亞綱(Sordariomycetidae)占總數(shù)的16%、銀耳綱占總數(shù)的7．2%、散囊菌綱(Eurotiales)占總數(shù)的2．8%等。在目水平上，格孢菌目占總數(shù)的26%、肉座菌目占總數(shù)的14%、散囊菌目占總數(shù)的2．7%、銀耳目(Tremellales)占總數(shù)的0．6%。

菌根真菌有59個(gè)OTUs，其中外生菌根真菌獲得56個(gè)OTUs，主要隸屬于紅菇科(Russulaceae)、硬皮馬勃科(Sclerodermataceae)、鎖瑚菌科(Clavulinaceae)、蠟殼耳科(Sebacinaceae)、革菌科(Thelephoraceae)等。叢植菌根真菌獲得3個(gè)OTUs，主要隸屬于球囊霉科(Glomeraceae)。

土壤真菌主要隸屬于線黑粉菌科(Filobasidiaceae)、被孢霉科(Mortierellaceae)等。研究發(fā)現(xiàn)隨文冠果林發(fā)育還出現(xiàn)一些特征菌，如枝孢菌屬(Cladosporium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、球座菌屬(Guignardia)、殼多孢菌屬(Stagonospora)、鏈格孢菌屬(Alternaria)、葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)、黑星菌屬(Venturia)等。

維恩圖(圖2)所示，S2樣地(S2+R2)共獲得760個(gè)OTUs，土壤真菌(S)與根內(nèi)共生真菌(R)共同有301個(gè)OTUs，S5樣地(S5+R5)共獲得632個(gè)OTUs，土壤真菌(S)與根內(nèi)共生真菌(R)共同有227個(gè)OTUs，S10樣地(S10+R10)共獲得593個(gè)OTUs，土壤真菌(S10)與根內(nèi)共生真菌(R10)共同有206個(gè)OTUs。

圖2 文冠果人工林不同樣地內(nèi)真菌群落組成的維恩圖

3．4 真菌群落的豐富度與多樣性

利用α多樣性分析真菌群落的豐富度。樣本的豐富度指數(shù)Chao1、均勻度指數(shù)ACE和多樣性指數(shù)Simpson/Shannon見表6。由表6可以看出，土壤與根內(nèi)的真菌豐富度指數(shù)Chao1隨林齡的增加均表現(xiàn)為略有減少的趨勢，表明隨文冠果林齡的增加土壤與植物根系的真菌物種數(shù)量可能減少。S2真菌群落Chao1數(shù)值明顯較高，S5和S10的數(shù)值變化不大，表明文冠果10年生林根內(nèi)的真菌物種數(shù)量相對穩(wěn)定。ACE指數(shù)變化顯示，隨文冠果林齡增長，土壤與根內(nèi)真菌群落均勻度先下降后上升。文冠果S2林未郁閉，林內(nèi)光線充足，林下植被較為豐富，土壤真菌的豐富度也隨之增加，S10林真菌群落結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。Simpson指數(shù)顯示，根內(nèi)真菌群落多樣性S2林較高，而土壤真菌群落多樣性S2林明顯低于S10林。Shannon多樣性指數(shù)逐年遞減。

表5 文冠果人工林根系及土壤樣本目分類水平上的真菌菌株OTUs

表6 文冠果根際土壤和根系真菌群落的豐富度和多樣性

3．5 土壤養(yǎng)分與真菌群落多樣性

通過SPSS對土壤理化性質(zhì)與群落多樣性進(jìn)行相關(guān)分析。由表7可以看出，全氮與速效磷含量與Chao1指數(shù)間存在顯著相關(guān)性。多樣性指數(shù)Shannon與全氮、速效氮、全磷、速效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)成正相關(guān)。

3．6 不同林齡真菌群落間的關(guān)系

對各林齡文冠果林真菌群落進(jìn)行主成分分析(圖3)，來自相同林齡樣地的土壤真菌群落呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，S2、S5、S10主要在PC1(貢獻(xiàn)率為12．56%)上分離，表明不同林齡文冠果真菌群落結(jié)構(gòu)組成差異較大。

表7 文冠果人工林土壤養(yǎng)分與真菌群落多樣性指數(shù)的相關(guān)性

圖3 真菌群落主成分(PCoA)分析

4 結(jié)論與討論

運(yùn)用第2代高通量測序技術(shù)，對文冠果人工林不同林齡根際真菌群落進(jìn)行了分析，并研究了真菌群落與環(huán)境之間的關(guān)系。結(jié)果表明，受文冠果林木發(fā)育的影響，土壤養(yǎng)分含量，真菌群落結(jié)構(gòu)、豐富度和多樣性均發(fā)生變化。文冠果S2林地土壤理化性質(zhì)、真菌群落豐富度指數(shù)、多樣性指數(shù)優(yōu)于S5及S10階段。S5和S10林地真菌群落變化相對平穩(wěn)，部分真菌形成優(yōu)勢種群。S10林地土壤肥力衰退，病原真菌群落增加。

PCoA分析結(jié)果顯示，不同林齡文冠果真菌群落結(jié)構(gòu)組成差異顯著。在S10林地中特征菌屬的出現(xiàn)可能與林地土壤質(zhì)量和生產(chǎn)力下降有關(guān)。球座菌屬、小光殼屬(Leptosphaerulina)、球腔菌屬(Mycosphaerella)包含許多危害嚴(yán)重的植物病原菌，其中M．a(chǎn)leuritidus是我國云南油桐黑斑病的致病菌。殼多孢菌部分病原真菌可造成植物葉斑病和根腐?。?6］。高通量測序共計(jì)705 990條OTUs代表序列讀數(shù)，其中，鐮刀菌屬、鏈格孢屬、球腔菌屬及青霉屬(Penicillium)真菌一共得到239 300條，占總讀數(shù)的33．9%。由此推測，文冠果人工林真菌群落多樣性降低可能與植物致病真菌占優(yōu)勢地位有關(guān)。在根內(nèi)真菌中有部分未鑒定真菌逐年遞增，推測可能其與文冠果根系生長發(fā)育有密切聯(lián)系，但因?qū)χ参飪?nèi)生菌知之甚少，所以需進(jìn)一步進(jìn)行生態(tài)和生理方面的研究。

土壤真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性會(huì)受多種因素的影響，外因主要有植被類型、氣候條件、土壤類型和人類活動(dòng)等，內(nèi)因主要有與土壤真菌生長密切相關(guān)的土壤有機(jī)質(zhì)組成和土壤養(yǎng)分含量等［27］。本研究表明，土壤有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)S5林高于S2林，而真菌群落豐富度指數(shù)S2林明顯高于S5林。原因可能在于:隨林木生長，植被凋落物、地下凋落物、土壤微生物殘?bào)w的分解與周轉(zhuǎn)及人工管理影響土壤有機(jī)質(zhì)含量［28］，土壤有機(jī)質(zhì)的積累促進(jìn)異養(yǎng)微生物的生長，進(jìn)而造成真菌群落豐富度的降低。另外，S2林未郁閉，林間光線充足，林下植被較為豐富，土壤真菌的豐富度也隨之增加。S5林、S10林真菌群落豐富度變化不大，原因可能是純林造成的土壤退化、容量增加等限制因素影響真菌群落的生長和代謝，從而導(dǎo)致真菌群落數(shù)量和豐度達(dá)到一定水平下的動(dòng)態(tài)平衡。

通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，土壤真菌豐富度指數(shù)和土壤中全氮和速效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著正相關(guān)。這一結(jié)果與何苑皞等［27］在杉木人工林土壤真菌遺傳多樣性中的研究結(jié)果一致，表明在土壤中可能存在某種真菌群落具有參與氮素與磷素周轉(zhuǎn)的功能。因此，土壤中的氮、磷含量成為該地區(qū)土壤真菌群落的生長限制因子。許多研究證實(shí)，土壤中氮素含量對土壤微生物生物量和群落組成有直接影響［29］。此外，有研究表明，部分真菌具有解磷功能，如青霉菌、曲霉菌(Aspergillus)、根霉菌(Rhizopus)、鐮刀菌和小菌核菌(Sclerotiumrolfsii)等［29］。此外，土地桿菌屬(Pedobacter)的部分菌株能夠產(chǎn)生植酸酶，可分解植物種子中的植酸磷，釋放出肌醇和無機(jī)磷，增加土壤中有效磷含量［30-32］。試驗(yàn)結(jié)果顯示，S2林真菌群落豐富度地明顯高于S5和S10階段，這一結(jié)果與土壤真菌樣本所得結(jié)果一致。Simpson指數(shù)顯示根內(nèi)真菌多樣性逐年降低，這與土樣中真菌多樣性呈現(xiàn)遞增趨勢正好相反。原因可能由于某種根內(nèi)真菌與植物根系形成共生體系，這種共生體系有助于根內(nèi)真菌的生長及繁殖，使其逐漸成為優(yōu)勢種群進(jìn)而影響其他根內(nèi)真菌群落的數(shù)量［33-35］。

本研究的對象是根際真菌的群落結(jié)構(gòu)，同時(shí)包括土壤樣本和植物根系樣本。采用這種取樣方式，可以更好地分析植物根系內(nèi)生真菌與根際土壤真菌之間的群落變化關(guān)系。另外，試驗(yàn)還存在一些不足，由測序結(jié)果可知根內(nèi)與土壤菌根真菌的OTU數(shù)量較少，原因可能與菌根PCR引物的特異性有關(guān)。試驗(yàn)僅關(guān)注環(huán)境對真菌群落結(jié)構(gòu)的變化影響，忽視了細(xì)菌對其產(chǎn)生的作用。上述存在的問題還需要進(jìn)一步分析。

［1］高述民，馬凱，杜希華，等．文冠果(Xanthoceras sorbifolia)研究進(jìn)展［J］．植物學(xué)通報(bào)，2002，19(3):296-297．

［2］謝志玉，張文輝，劉新成．干旱脅迫對文冠果幼苗生長和生理生化特征的影響［J］．西北植物學(xué)報(bào)，2010，30(5):948-954．

［3］劉麗，徐明愷，汪思龍，等．杉木人工林土壤質(zhì)量演變過程中土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化［J］．生態(tài)學(xué)報(bào)，2013，33(15):4692-4706．

［4］田地，馬欣，李玉娥，等．利用高通量測序?qū)Ψ獯鍯O2泄漏情景下土壤細(xì)菌的研究［J］．環(huán)境科學(xué)，2013，34(10):4096-4104．

［5］Benayas J M R，Newton A C，Diaz A，et al．Enhancement of biodiversity and ecosystem services by ecological restoration:ameta-analysis［J］．Science，2009，325:1121-1124．

［6］Doran J W，Zeiss M R．Soil health and sustainability:managing the biotic component of soil quality［J］．Applied Soil Ecology，2000，15(1):3-11．

［7］Rillig M C．Arbuscularmycorrhizae and terrestrial ecosystem processes［J］．Ecological Letters，2004，7(8):740-754．

［8］Celik I，Ortas I，Kilic S．Effects of compost，mycorrhiza，manure and fertilizer on some physical properties of a Chromoxerert soil［J］．Soil＆Tillage Research，2004，78(1):59-67．

［9］Kolb S E，F(xiàn)ermanich K J，Dornbush M E．Effect of charcoal quantity on microbial biomass and activity in temperate soils［J］．Soil Science Society of America Journal，2009，73(4):1173-1181．

［10］楊玉海，陳亞寧，蔡柏巖，等．極端干旱區(qū)胡楊根圍叢枝菌根真菌的分離與鑒定［J］．干旱區(qū)地理，2012，35(2):260-266．

［11］職桂葉，陳欣，唐建軍．叢枝菌根真菌(AMF)對植物群落調(diào)節(jié)的研究進(jìn)展［J］．菌物系統(tǒng)，2003，22(4):678-682．

［12］閆紹鵬，楊瑞華，冷淑嬌，等．高通量測序技術(shù)及其在農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中的應(yīng)用［J］．中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28(30):171-176．

［13］陳祥偉，陳立新，劉偉琦．不同森林類型土壤氮礦化的研究［J］．東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，27(1):5-9．

［14］Fierer N，Jackson R B．The diversity and biogeography of soil bacterial communities［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences USA，2006，103(3):626-631．

［15］Lauber C L，Hamady M，Knight R，et al．Pyrosequcing-based assessment of soil pH as a predictor of soil bacterial community structure at the continental scale［J］．Applied＆Environmental Microbiology，2009，75(15):5111-5120．

［16］Rousk J，B??th E，Brookes P C，et al．Soil bacterial and fungal communities across a pH gradient in an arable soil［J］．The ISME Journal，2010，4(10):1340-1351．

［17］劉光崧．中國生態(tài)系統(tǒng)研究網(wǎng)絡(luò)觀測與分析標(biāo)準(zhǔn)方法:土壤理化分析與剖面描述［M］．北京:標(biāo)準(zhǔn)出版社，1996．

［18］吳敏娜，張惠文，李新宇，等．提取北方土壤真菌DNA的一種方法［J］．生態(tài)學(xué)雜志，2007，26(4):611-616．

［19］Schloss P D，Westcott SL，Ryabin T，et al．Introducingmothur:open-source，platform-independent，community-supported software for describing and comparing microbial communities［J］．Appl Environ Microbiol，2009，75(23):7537-7541．

［20］Caron D A，Countway P D，Savai P，et al．Defining DNA-baesd operational taxonomic units for microbial-eukaryote ecology［J］．Applied and Environment Microbiology，2009，75(18):5797-5808．

［21］Toju H1，Yamamoto S，Sato H，et al．Community composition of root-associated fungi in a Quercus-dominated temperate forest:“codominance”of mycorrhizal and root-endophytic fungi［J］．Ecology and Evolution，2013，3(5):1281-1293．

［22］Chao A．Nonparametric estimating the number of classes in a population［J］．Scandinavian Journal of Statistics，1984，11(4):265-270．

［23］Chao A，Lee S M．Estimating the number of classes via sample coverage［J］．Journal of the American Statistic Association，1992，87:210-217．

［24］Li Xiaogang，Ding Changfeng，Zhang Taolin，et al．Fungal pathogen accumulation at the expense of plant-beneficial fungi as a consequence of consecutive peanut monoculturing［J］．Soil Biology＆Biochemistry，2014，72:11-18．

［25］Edgar R C．Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST［J］．Bioinformatics，2010，26(19):2460-2461．

［26］陳鵬，劉宏屏，王達(dá)明，等．云南油桐黑斑病危險(xiǎn)性分析［J］．林業(yè)調(diào)查規(guī)劃，2006，31(2):116-118．

［27］何苑皞，周國英，王圣潔，等．杉木人工林土壤真菌遺傳多樣性［J］．生態(tài)學(xué)報(bào)，2014，34(10):2725-2736．

［28］Frey SD，Knorr M，Parrent JL，et al．Chronic nitrogen enrichment affects the structure and function of the soil microbial community in temperate hardwood and pine forests［J］．Forest Ecology and Management，2004，196(1):159-171．

［29］沈海龍，丁寶永，沈國舫，等．樟子松人工林下針闊葉凋落物分解動(dòng)態(tài)［J］．林業(yè)科學(xué)，1996，32(5):393-402．

［30］陳立新，陳祥偉，史桂香，等．提高落葉松人工林林地質(zhì)量的研究［J］．東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，26(3):6-11．

［31］王桂君，Ohsowoski B，李玉，等．菌根菌劑及土壤改良劑對退化生態(tài)系統(tǒng)的修復(fù)潛能分析［J］．生態(tài)經(jīng)濟(jì)，2014，30(7):179-184．

［32］譚艷，王邵軍，阮宏華，等．不同林齡楊樹人工林土壤動(dòng)物群落結(jié)構(gòu)特征［J］．南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2014，38(3):8-12．

［33］袁亮，李絮花，李潤，等．設(shè)施栽培土壤磷酸酶活性及其與土壤養(yǎng)分的關(guān)系［J］．山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007(3):80-83．

［34］段思蒙，申佩弘，潘莉莉，等．PCR-RFLP分析桉樹人工林土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)［J］．基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28(5):859-864．

［35］Schloss P D，Westcott T，Ryabin JR，et al．Introducing mothur:open-source，platform-independent，community-supported software for describing and comparing microbial communities［J］．App Environ Microbiol，2009，75(23):7537-7541．