林燕青 楊秀蓮 王良桂

(南京林業(yè)大學(xué)，南京，210037)

責(zé)任編輯:任 俐。

海州常山(Clerodendrum trichotomum Thumb．)為馬鞭草科(Verbenaceae)大青屬(Clerodendrum L．)小喬木或灌木［1］?；ㄐ虼螅üG麗，花、花萼、果可共存于同一樹上，白、紅、蘭3種顏色交替生輝，觀賞期長達半年，是既可觀花，又可冬季觀果的優(yōu)良花木［2－3］。海州常山還具有較強的抗旱、耐瘠薄、耐鹽堿能力，是一種很有潛力的城市廢棄地恢復(fù)植物種。此外，海州常山的莖葉均具有一些重要的藥用成分［4］，可以醫(yī)治腫瘤、高血壓等多種疾病，是一種極具經(jīng)濟價值的野生植物，極具開發(fā)潛力。

近年來，有關(guān)海州常山的研究多集中在其抗性機理方面，鮮有海州常山花粉的相關(guān)研究。花粉是植物重要的種質(zhì)材料，其活力直接影響到植物的遺傳、育種、進化、生殖等的效率和能力［5－7］?；ǚ刍盍Φ难芯繉θ斯な诜酆碗s交育種，解決花期不遇等問題具有極其重要的意義。

花粉生活力的測定常用的方法有:花粉直接授粉、花粉人工萌發(fā)和花粉染色法鑒定等［8］。文中對多種花粉活力測定方法進行了比較研究，篩選出了最適宜于海州常山花粉活力測定的方法，探究了海州常山花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基及最佳培養(yǎng)條件。同時比較了海州常山花期及花粉采集時間對其花粉萌發(fā)率的影響。旨在探究保持較強海州常山花粉活力及花粉達到最佳萌發(fā)效果所需條件，為海州常山的種質(zhì)資源保存及育種提供參考。

1 材料與方法

用于研究花粉活力及萌發(fā)條件的材料來自江蘇鹽城海州常山基地，研究花粉活力測定方法、花期及花粉采集時間對花粉萌發(fā)影響的材料來自南京林業(yè)大學(xué)校園及南京紫金山，采集時間為2014年8月中下旬。

用移液槍分裝0．1 mL液體培養(yǎng)基于每個雙孔凹玻片孔內(nèi)，使用牙簽將待試花粉均勻點入培養(yǎng)液中，使其充分混合，將凹玻片放入鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置于25℃光照人工氣候箱中培養(yǎng)6 h。在40倍電鏡下觀察統(tǒng)計花粉萌發(fā)率，每處理統(tǒng)計3個視野，每個視野花粉粒數(shù)不少于50粒，每試驗3個重復(fù)，花粉萌發(fā)以花粉管長度大于花粉粒直徑為標準［9－10］。

花粉萌發(fā)率=(萌發(fā)的花粉粒數(shù)/花粉粒總數(shù))×100%。

花粉萌發(fā)法:設(shè)置不同質(zhì)量濃度糖溶液，包括淀粉、乳糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖，質(zhì)量濃度梯度均為0、50、100、150、200、300 g·L－1，篩選最適宜于海州常山花粉萌發(fā)的糖因子。硼酸質(zhì)量濃度梯度設(shè)置為0、50、100、200、300、500 mg·L－1，氯化鈣質(zhì)量濃度梯度設(shè)為0、50、150、250、350、500 mg·L－1，確定最佳單因子培養(yǎng)基［11］。

將各質(zhì)量濃度梯度硼酸及氯化鈣液體培養(yǎng)基分別配置其pH值為5．5、6．0、6．5，培養(yǎng)海州常山花粉6 h，觀察統(tǒng)計其萌發(fā)率，研究比較硼酸及氯化鈣的pH值與質(zhì)量濃度對花粉萌發(fā)率的交互作用［11］。

在單因子試驗的基礎(chǔ)上，進行L25(53)正交試驗［11－12］，與最佳單因子組合相比較，選取對海州常山花粉萌發(fā)影響最大的培養(yǎng)基組合。

在最佳培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，設(shè)置以下4個方案來探究海州常山花粉最佳培養(yǎng)條件:于25、35、45℃黑暗條件下培養(yǎng)花粉6 h，觀察統(tǒng)計花粉萌發(fā)率，探究短時高溫對花粉萌發(fā)率的影響;將海州常山花粉于黑暗與光照下培養(yǎng)6 h，比較花粉萌發(fā)狀況，研究光照條件對海州常山花粉萌發(fā)率的影響;分別培養(yǎng)花粉2、4、6、8、10、12、24 h，確定海州常山花粉最適宜的培養(yǎng)時間;將同樣的花粉均勻分為6份，分別放置于鋪有玻璃紙的培養(yǎng)皿中，放入烘箱25℃，分別干燥1、3、6、9、12、24 h后取出，待其溫度達到室溫，培養(yǎng)干燥后的花粉，統(tǒng)計花粉萌發(fā)率，確定海州常山花粉最適宜干燥時間［11－12］。

花粉活力測定方法:花粉活力測定采用染色法和離體培養(yǎng)法，染色法有碘－碘化鉀染色法、TTC染色法、聯(lián)苯胺染色法。離體培養(yǎng)法有無機酸刺激花粉管伸長的硫酸(質(zhì)量分數(shù)梯度為7．2%、14．4%、28．0%)培養(yǎng)法和液體萌發(fā)法［13］。

花期及花粉采集時間對花粉萌發(fā)率的影響:選擇晴朗的天氣，分別采集花蕾期、開花第1天～第2天、開花第3天、花謝后的海州常山花粉進行液體培養(yǎng)，統(tǒng)計花粉萌發(fā)率，確定采集海州常山花粉的最佳時期［6］。分別在同一天的08:00、12:00、16:00采集盛花期且生長健壯植株的花粉，收集于聚乙烯離心管中，迅速帶回實驗室培養(yǎng)并測定其萌發(fā)率，確定海州常山花粉采集的最適時間。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析:測定數(shù)據(jù)使用EXCEL及SPSS19．0軟件進行處理。

2 結(jié)果與分析

2．1 海州常山花粉活力測定方法的分析比較

本試驗采用3種染色法(TTC、聯(lián)苯胺、碘－碘化鉀染色法)和2種離體培養(yǎng)法(液體培養(yǎng)法、硫酸培養(yǎng)法)測定海州常山花粉活力。試驗結(jié)果顯示，染色法測定海州常山花粉活力效果并不明顯，海州常山花粉為深紫色，所以采用染色法無法區(qū)分出花粉是否被染色，不適宜用于海州常山花粉活力的測定。由表1顯示，經(jīng)無機酸培養(yǎng)法測定的海州常山花粉活力極顯著低于經(jīng)液體培養(yǎng)法測定的花粉活力，經(jīng)14．4%質(zhì)量分數(shù)硫酸測定的花粉活力為27．12%，相對較高;經(jīng)7．2%質(zhì)量分數(shù)硫酸測定的花粉活力為14．23%;經(jīng)28．0%質(zhì)量分數(shù)硫酸處理造成了花粉細胞的質(zhì)壁分離，萌芽率為7．84%;試驗采用14．4%質(zhì)量分數(shù)的硫酸測定花粉的活力。液體培養(yǎng)法(150 g·L－1蔗糖溶液)測定的海州常山花粉活力為72．27%，可以直接觀察花粉管的發(fā)育情況，能較好地反映花粉的萌發(fā)率。故采用液體培養(yǎng)法可更準確的測定海州常山花粉的活力。

表1 液體培養(yǎng)法與硫酸培養(yǎng)法測定海州常山花粉活力比較

2．2 單因子對海州常山花粉萌發(fā)的影響

2．2．1 不同糖因子對花粉萌發(fā)率的影響

由表2顯示，5種糖因子中，經(jīng)質(zhì)量濃度為150 g·L－1蔗糖培養(yǎng)的花粉萌發(fā)率最高，達到22．84%，與經(jīng)葡萄糖、淀粉、乳糖及麥芽糖培養(yǎng)的花粉萌發(fā)率差異均顯著，可知150 g·L－1蔗糖可以更加有效地提高海州常山花粉的萌發(fā)率。

表2 不同質(zhì)量濃度各種糖因子對海州常山花粉萌發(fā)率的影響

2．2．2 單因子對花粉萌發(fā)率的影響

硼酸、蔗糖、氯化鈣對海州常山花粉萌發(fā)均有顯著作用。質(zhì)量濃度為200 mg·L－1的硼酸溶液可以極顯著地提高花粉萌發(fā)率，達到20．04%，且與經(jīng)其他質(zhì)量濃度的硼酸溶液培養(yǎng)的花粉萌發(fā)率差異均極顯著;經(jīng)500 mg·L－1硼酸溶液培養(yǎng)的花粉萌發(fā)率為8．81%，與對照組(蒸餾水)所培養(yǎng)花粉的萌發(fā)率(4．35%)差異不顯著;經(jīng)其余質(zhì)量濃度的硼酸培養(yǎng)的花粉萌發(fā)率均與對照組差異呈顯著水平。經(jīng)150 mg·L－1氯化鈣溶液培養(yǎng)下的花粉萌發(fā)率達到22．27%，極顯著的高于經(jīng)0、50、250、350、500 mg·L－1氯化鈣溶液培養(yǎng)下的花粉萌發(fā)率，后五者之間差異均不顯著。150 g·L－1蔗糖溶液可極顯著的提高花粉萌發(fā)率，達到22．84%，與經(jīng)0、50、100、200、300 g·L－1蔗糖溶液培養(yǎng)下的花粉萌發(fā)率差異均呈極顯著水平。由此可見，適宜濃度的硼酸、氯化鈣、蔗糖溶液均可有效提高花粉萌發(fā)率，質(zhì)量濃度過低或過高的培養(yǎng)液會抑制花粉的萌發(fā)。

2．2．3 不同質(zhì)量濃度、pH值硼酸和氯化鈣對花粉萌發(fā)率的影響

由表3可以看出，當硼酸質(zhì)量濃度為50～200 mg·L－1時，花粉萌發(fā)率隨著硼酸質(zhì)量濃度的增大而逐漸升高，但隨著pH值的升高而降低，可見硼酸質(zhì)量濃度為200 mg·L－1，pH=5．5的情況下花粉萌發(fā)率最高。

當氯化鈣質(zhì)量濃度為150 mg·L－1、pH=5．5的情況下花粉萌發(fā)率較顯著高于其他兩種pH值下的萌發(fā)率。結(jié)合2．2．2的結(jié)論，可以得出硼酸及氯化鈣pH值對花粉萌發(fā)率的影響沒有其質(zhì)量濃度對萌發(fā)的影響顯著，且硼酸和氯化鈣溶液的pH值為5．5時，更適宜海州常山花粉的萌發(fā)。

表3 不同質(zhì)量濃度、pH值硼酸和氯化鈣對花粉萌發(fā)率的影響

2．3 蔗糖、硼酸、氯化鈣三因子正交試驗結(jié)果

由表4顯示，第1到第25組為正交試驗組合，第26組為2．2．2得出的最佳單因子組合。正交試驗結(jié)果顯示，海州常山花粉在第23組(蔗糖200 g·L－1+硼酸200 mg·L－1+氯化鈣150 mg·L－1)培養(yǎng)基配方下的花粉萌發(fā)率是最高的，達到22．02%。其次為第18組(蔗糖150 g·L－1+硼酸200 mg·L－1+氯化鈣50 mg·L－1)培養(yǎng)基配方下的花粉萌發(fā)率，為20．57%。在2．2．2試驗的基礎(chǔ)上，蔗糖、硼酸、氯化鈣最佳單因子的組合(第26組:蔗糖150 g·L－1+硼酸200 mg·L－1+氯化鈣150 mg·L－1)培養(yǎng)基配方下的花粉萌發(fā)率達到28．07%，與正交組合的第23組培養(yǎng)基下花粉萌發(fā)率差異不顯著外，與其他正交組合的花粉萌發(fā)率均達到極顯著差異。

綜上所述，海州常山花粉離體培養(yǎng)的最佳液體培養(yǎng)基配方為最佳單因子組合:蔗糖150 g·L－1+硼酸200 mg·L－1+氯化鈣150 mg·L－1。

表4 海州常山花粉正交試驗的萌發(fā)率

2．4 不同培養(yǎng)條件對花粉萌發(fā)率的影響

光照條件的選擇:在光照及黑暗條件下培養(yǎng)海州常山花粉，比較其萌發(fā)率，探究光照條件對海州常山萌發(fā)的影響。試驗結(jié)果顯示，光照條件下培養(yǎng)的海州常山花粉萌發(fā)率為24．32%，黑暗培養(yǎng)的海州常山花粉萌發(fā)率為21．10%，可見光照條件下培養(yǎng)海州常山花粉萌發(fā)率略高于黑暗培養(yǎng)的花粉萌發(fā)率。

培養(yǎng)時間的選擇:海州常山花粉在培養(yǎng)8 h后其萌發(fā)率基本不再變化，且出現(xiàn)斷芽及模糊現(xiàn)象。海州常山花粉在培養(yǎng)不同時間段后，花粉萌發(fā)率差異顯著。培養(yǎng)8 h的花粉萌發(fā)率達到最高，為27．99%，且極顯著地高于培養(yǎng)2、4 h后的花粉萌發(fā)率，而與培養(yǎng)6、10、12、24 h下的花粉萌發(fā)率差異均不顯著?？芍Ｖ莩Ｉ交ǚ叟囵B(yǎng)的最佳時間為8 h。

培養(yǎng)溫度的選擇:在高于25℃的高溫條件下海州常山花粉萌發(fā)率達到21．01%，且隨著溫度的升高而極顯著下降，溫度升高為35、45℃時，萌發(fā)率分別下降為14．06%、10．01%?？梢姕囟忍邥Ｖ莩Ｉ交ǚ刍盍υ斐善茐模焕诨ǚ鄣拿劝l(fā)。因此，海州常山花粉萌發(fā)的適宜溫度為25℃。

最佳含水量的選擇:海州常山花粉干燥1～9 h時，花粉萌發(fā)率隨著干燥時間的延長而不斷提高，干燥9 h以后花粉萌發(fā)率呈下降趨勢。干燥9 h后花粉萌發(fā)率達到最高，為25．35%，與干燥6 h的花粉萌發(fā)率(21．01%)差異不顯著外，與其他干燥時間下的花粉萌發(fā)率均達極顯著水平。干燥9 h后花粉萌發(fā)率與不進行干燥處理的花粉萌發(fā)率(16．12%)達顯著水平。由試驗結(jié)果可得，海州常山花粉在25℃條件下干燥9 h較適宜。

2．5 海州常山花期與花粉采集時間對花粉萌發(fā)率的影響

為探究海州常山花粉采集的最佳時間，本試驗在不同花期及一天中不同時間采集海州常山花粉，進行離體培養(yǎng)，統(tǒng)計其萌發(fā)率。試驗結(jié)果顯示，花蕾期的花粉萌發(fā)率為72．43%，與開花第1～第2天花粉萌發(fā)率(79．28%)差異不顯著，但均與開花第3 d花粉萌發(fā)率(56．02%)差異極顯著?；ㄖx后其花粉萌發(fā)率(8．70%)與前3種情況下的花粉萌發(fā)率差異均達極顯著水平?？梢娫诨ɡ倨诩伴_花2 d內(nèi)花粉活力相對較高，開花第1～第2 d時花粉活力最強。

于08:00采集的海州常山花粉萌發(fā)率為75．20%，12:00采集的海州常山花粉萌發(fā)率為62．24%，二者差異不顯著，但均與16:00采集的海州常山花粉萌發(fā)率(41．73%)有極顯著差異。隨著1 d中時間的延續(xù)，花粉萌發(fā)率顯著下降，從而得出，海州常山花粉活性在1 d中的08:00較高。可知海州常山的花粉采集及人工野外輔助授粉等作業(yè)適宜在08:00進行，此時花粉活力較強。

3 結(jié)論與討論

糖類物質(zhì)在花粉萌發(fā)和花粉管生長中起著重要的作用，蔗糖起著維持花粉與培養(yǎng)基之間滲透平衡的作用，也是花粉萌發(fā)的營養(yǎng)物質(zhì)和能量來源［14］。在花粉萌發(fā)過程中，硼酸具有增加糖的吸收、轉(zhuǎn)運和代謝，幫助形成胞外Ca2+梯度，促進花粉萌發(fā)和花粉管生長等作用［15］。鈣離子主要是在蔗糖和硼酸的主導(dǎo)作用下起輔助作用，而這種作用對啟動花粉萌發(fā)和調(diào)節(jié)花粉管生長是必須的［16］。由試驗得出，空白對照下海州常山花粉萌發(fā)率為3．75%，150 g·L－1蔗糖培養(yǎng)下海州常山的花粉萌發(fā)率顯著提高到22．84%，200 mg·L－1硼酸下海州常山花粉萌發(fā)率達到20．04%，與大花蕙蘭［17］(Cymbidium hybridium)相同，150 mg·L－1的氯化鈣顯著提高了花粉萌發(fā)率。試驗中，經(jīng)150 mg·L－1氯化鈣培養(yǎng)下的花粉萌發(fā)率達到22%，相對于硼酸及氯化鈣質(zhì)量濃度對花粉萌發(fā)率的影響，其pH值對海州常山花粉萌發(fā)率的影響并不顯著。海州常山花粉在硼酸及氯化鈣pH值為5．5時其萌發(fā)率較pH值為6．0、6．5的情況下萌發(fā)率高。

正交試驗中蔗糖、硼酸、氯化鈣之間的交互作用并不明顯，但由單因素試驗所選出的最佳質(zhì)量濃度單因子組合150 g·L－1蔗糖+200 mg·L－1硼酸+150 mg·L－1氯化鈣則可顯著提高花粉萌發(fā)率，蔗糖和硼酸對海州常山花粉的萌發(fā)起最主要作用，鈣離子次之。

培養(yǎng)條件不同，海州常山花粉萌發(fā)率也達到顯著不同，與黃連木(Pistacia chinensis)［18］、無距蝦脊蘭［19］相同，海州常山花粉最適宜萌發(fā)溫度為25℃，可見海州常山花粉采集及野外授粉等活動適宜在25℃溫度條件下進行。

一定的含水量對花粉的萌發(fā)率及低溫貯存有重要的意義，試驗中海州常山在烘箱中25℃干燥9 h可顯著提高花粉萌發(fā)率，超過9 h其活力顯著下降。由此可見，采集的海州常山花粉不適宜長時間暴露在外。廣玉蘭［20］花粉培養(yǎng)2 h，楸樹花粉［21］培養(yǎng)6 h，其花粉萌發(fā)狀態(tài)最佳，試驗中海州常山花粉需要培養(yǎng)8 h達最佳萌發(fā)狀態(tài)，可能因為不同植物花粉的結(jié)構(gòu)與適應(yīng)性有差異，因此，所需培養(yǎng)時間也不同。

花粉生活力的測定在育種和種質(zhì)保存中具有重要意義［22－23］。本試驗中，染色法對海州常山花粉的染色效果不佳，海州常山花粉自身為深紫色，使用染色法測定活力很難區(qū)分其是否被染色，有效且可快速測定海州常山花粉活力方法為液體培養(yǎng)法。海州常山活力的測定較適宜的染色法仍需要進一步的試驗研究。

花粉在不同的發(fā)育時期其活力顯著不同，試驗得出海州常山在開花第1～第2天其花粉萌發(fā)率達到最高。1 d中海州常山花粉活力也是不同的，在08:00花粉活力較強，萌發(fā)率較高，隨著時間的延續(xù)，海州常山花粉活力不斷的降低。因此，收集花粉及人工輔助授粉適宜在花期1～2 d完成，于08:00進行效果較好。試驗中于南京采集的海州常山花粉萌發(fā)率遠大于從鹽城試驗基地所采集海州常山的花粉萌發(fā)率，可知長距離及長時間的攜帶對海州常山花粉萌發(fā)率影響較大。

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