耿菲菲 肖豐坤 吳濤 陳芳 楊宇明 王娟

(西南林業(yè)大學，昆明，650224) (云南省林業(yè)科學院)

責任編輯:程 紅。

思茅松(Pinus kesiya var．langbianensis)是松科松屬常綠喬木，主要分布在云南中南部海拔1 800 m以下地區(qū)，是云南省重要的速生、造林、采脂及用材針葉樹種。思茅松一年可長2輪枝條，10～12年生時即可采脂，優(yōu)選的高產(chǎn)脂植株及其它特定培育目的類型的優(yōu)株亟待推廣。建立無性系可將其遺傳增益最大化，也是解決木材短缺、培育定向工業(yè)原料林的有效途徑，其中無性系繁育是前提條件。我國學者已從扦插［1-2］、針葉束水培［3］、叢生芽誘導［4］、體細胞胚胎發(fā)生［5］等途徑對思茅松無性系繁育做了許多工作。植物體細胞胚胎發(fā)生(簡稱體胚發(fā)生)具有數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整、成苗率高等優(yōu)點，對于生長周期較長的松屬樹種來說，該途徑可快速形成數(shù)量多、性狀穩(wěn)定的再生植株，不但是遺傳轉(zhuǎn)化最佳的受體系統(tǒng)，更是最有希望大規(guī)模繁殖優(yōu)良無性系的方法［6］，該研究將為定向培育高產(chǎn)脂思茅松和速生優(yōu)質(zhì)思茅松個體奠定重要基礎。

自1985年Hakman和von Arnold［7］首次報道挪威云杉(Picea abies)的未成熟合子胚形成體細胞胚并再生植株以來，體胚發(fā)生技術(shù)在松科植物中得到了迅速的發(fā)展和廣泛的研究。目前已有糖松(Pinus lambertiana)［8］、濕地松(P．elliottii)［9］和紅松(P．koraiensis)［10］等10多種松屬樹種通過體胚發(fā)生途徑獲得了再生植株。以成熟種子的合子胚作外植體，材料容易獲得且不受取材時間限制，容易保存并可全年用于研究，但存在誘導困難或誘導率低的問題。吳濤等［5］以特定發(fā)育階段的未成熟合子胚為外植體，獲得了思茅松的胚性愈傷組織，但誘導率很低，不足2%;而其用成熟胚為外植體未能得到胚性愈傷組織。由于樹種特性，松屬植物的體胚發(fā)生研究較其它樹種更為困難，胚性愈傷誘導時外植體的選擇和誘導率的提高尚有很大研究空間。為建立思茅松成熟胚的體細胞胚胎發(fā)生體系，提高其胚性愈傷組織誘導及增殖率，筆者利用正交試驗探索成熟胚為外植體誘導愈傷組織的最適激素質(zhì)量濃度配比，采用不同培養(yǎng)方式對胚性愈傷組織進行增殖，以期選擇出最優(yōu)增殖培養(yǎng)基，為其無性育苗提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

思茅松成熟種子于2013年初采于云南省西雙版納州普文鎮(zhèn)熱帶林業(yè)研究所思茅松種子園內(nèi)，干燥后密封，于冰箱中4℃保存。使用前先用自來水浸泡24～48 h，浮選法篩去空癟種子，余下的飽滿種子備用。

外植體消毒與接種:用醫(yī)用剪刀和解剖刀將外植體種殼去掉后，再用0．1%升汞溶液分別浸泡并搖晃6、8、10、15 min進行消毒，后用滅菌的純凈水沖洗5次。用滅菌解剖刀和鑷子劃開胚乳，取出種胚水平接種于培養(yǎng)基表面。每個9 cm培養(yǎng)皿接種15個外植體，重復10次。接種7 d后記錄外植體污染情況和生長情況，選出最佳消毒時間。

誘導培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件:以1/2MSG培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，pH=5．7～5．8、添加麥芽糖15．00 g·L-1、水解酪蛋白1．00 g·L-1、肌醇0．50 g·L-1、硝酸銀0．34 mg·L-1、MES250．00 mg·L-1、活性炭50．00 mg·L-1、植物凝膠4．00 g·L-1，高溫滅菌后過濾加入谷氨酰胺750 mg·L-1。附加不同濃度的激素(表1)后配置成誘導培養(yǎng)基。黑暗培養(yǎng)，溫度為22～25℃。

正交試驗設計:利用L9(34)正交表，考察2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)、6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)、TRIA(三十烷醇)的質(zhì)量濃度對思茅松成熟胚誘導胚性愈傷組織的影響，其因素水平見表1。每試驗接45個外植體，重復3次。

表1 植物激素配比對思茅松胚性愈傷組織誘導的正交設計

愈傷組織形態(tài)學與細胞學觀察:接種后，每隔3～5 d觀察記錄愈傷組織的誘導情況，包括愈傷組織產(chǎn)生的時間、部位、形態(tài)、質(zhì)地、大小、顏色，以及污染情況。20～30 d將誘導出來的愈傷組織挑取到載玻片上分別用蒸餾水和卡寶品紅染液進行壓片。用體視鏡(Leica M165FC)和顯微鏡(Leica DMLS)進行外植體和組織細胞觀察。記錄并統(tǒng)計胚性愈傷組織誘導情況。

愈傷組織的增殖培養(yǎng):將誘導出的愈傷組織接種于增殖培養(yǎng)基，為了保證愈傷組織的質(zhì)量，增殖培養(yǎng)基采用激素質(zhì)量濃度逐次遞減的方式，即激素含量依次減為誘導培養(yǎng)基的1/2、2/5、1/5、1/10，其中2，4-D改用NAA代替。NAA含量逐漸降低為1．0、0．8、0．4、0．2 mg·L-1，TRIT不添加，肌醇增加到1．0 g·L-1，其它成分不變［11］。每2周繼代一次，每次轉(zhuǎn)接時均選取新分化的愈傷組織，并在其周圍放置少量原培養(yǎng)基［12］。愈傷組織增殖初步效果不理想，所以另設計4種增殖培養(yǎng)基，以期尋找更適合增殖培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基和激素處理。從繼代3次的8號增殖培養(yǎng)基中，即激素質(zhì)量濃度降為誘導培養(yǎng)基的1/5，選出一個增殖緩慢的胚性細胞系，并取出大小約為1 cm3的8塊愈傷組織，分別接于A、B、C、D 4種培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基接種2塊。這4種培養(yǎng)基應用了兩種基本培養(yǎng)基，并添加了不同質(zhì)量濃度的2，4-D、NAA和6-BA。具體處理見表2。其它成分不變。

表2 新增的4種增殖培養(yǎng)基和原增殖培養(yǎng)基的成分配比

2 結(jié)果與分析

2．1 消毒時間對污染率的控制效果

試驗最開始直接使用帶種殼的思茅松種子進行消毒，發(fā)現(xiàn)將消毒時間從5 min延長至30 min，均不能很好的降低污染率，真菌和細菌污染都較為嚴重，推測可能是種子暴露在外界環(huán)境中時間較久，簡單漂浮清洗后直接用HgCl2消毒并不能有效抑制或去除表面微生物。因此，將浮選法挑選出的種子去掉種殼后，再用0．1%HgCl2溶液進行不同時間的消毒處理，結(jié)果見表3。當消毒時間小于8 min時，污染率明顯偏高;大于8 min時，污染率基本不變，但部分外植體活力降低，40 d后不膨大也不生長。據(jù)此，最佳消毒時間選定為8 min。

表3 消毒時間對思茅松外植體滅菌效果的影響

2．2 激素對愈傷組織誘導率的影響

9組正交試驗的胚性愈傷誘導率依次為26．75%、27．07%、12．50%、86．67%、79．26%、87．77%、24．79%、43．22%、18．25%。由表4可見，影響胚性愈傷組織誘導率的因素由大到小依次為:A、C、B，即3種激素對思茅松成熟胚誘導胚性愈傷組織影響最大的是2，4-D，其次是TRIA，6-BA的影響最小。其中，A因素影響極顯著，B因素和C因素影響不顯著。正交試驗最優(yōu)組合為A2B2C1，即2，4-D為5．000 mg·L-1、6-BA為4．000 mg·L-1、TRIA為0．005 mg·L-1。為了驗證所得結(jié)論的正確性，選擇正交試驗中胚性愈傷誘導率最高的6號與最佳組合條件比較，進行胚性愈傷誘導率的對照試驗，結(jié)果表明其胚性愈傷誘導率分別為87．77%和88．35%，最佳組合條件下的胚性愈傷誘導率高于6號條件下的胚性愈傷誘導率，說明正交試驗優(yōu)選出的較優(yōu)條件是正確的。

2．3 胚性細胞系的增殖培養(yǎng)

將產(chǎn)生的愈傷組織進行增殖培養(yǎng)，每14 d選取新分化的愈傷組織轉(zhuǎn)接至質(zhì)量濃度逐步降低的增殖培養(yǎng)基，胚性愈傷組織生長緩慢，部分出現(xiàn)褐化。20～30 d后，部分褐化的愈傷組織上會重新長出白色絲狀的胚性愈傷組織。重新形成的胚性愈傷組織分裂能力強，生命力旺盛，可快速增殖。不同類型愈傷組織增殖情況見表5。胚性愈傷組織如不及時進行增殖培養(yǎng)，即在含高質(zhì)量濃度激素的誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d后，愈傷組織開始褐化。但即使及時繼代，胚性愈傷組織也很容易褐化死亡。

表4 植物激素配比對思茅松胚性愈傷組織誘導的正交試驗結(jié)果

表5 思茅松不同愈傷組織類型的增殖培養(yǎng)情況

由于胚性愈傷組織在初始設計的NAA和6-BA質(zhì)量濃度遞減試驗中增殖情況不理想，為了尋找更優(yōu)的增殖培養(yǎng)基，設計了A、B、C、D 4種增殖培養(yǎng)基。胚性愈傷組織培養(yǎng)20 d時，4種增殖培養(yǎng)基和原增殖培養(yǎng)基的增殖情況見表6。由此可知，增殖培養(yǎng)基D較好?？赡苁窃鲋撑囵B(yǎng)時，改用不同的基本培養(yǎng)基并用NAA代替2，4-D，更有利于胚性愈傷組織的增殖;也可能是D增殖培養(yǎng)基比較適合這一發(fā)育狀態(tài)的胚性細胞系，其原因還需進一步的確定。

表6 新培養(yǎng)基和原增殖培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果

2．4 外植體誘導過程中的外觀和細胞組織觀察

成熟合子胚在培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后，明顯變粗膨大，子葉展開，無愈傷組織產(chǎn)生(圖1A);培養(yǎng)4～7 d，從下胚軸開始產(chǎn)生乳白色半透明黏狀組織(圖1B)。10 d后在胚軸或子葉處產(chǎn)生多種愈傷組織:①白色或紅色、半透明絲狀，晶亮有黏性，結(jié)構(gòu)松軟，表面具有透明凸起(圖1C);②濕潤淺綠色或白色透明愈傷組織，質(zhì)地松軟，產(chǎn)生于子葉或胚根(圖1D);③黃白色或黃褐色，質(zhì)地較堅硬，細胞排列緊密較小(圖1E);④淺黃褐色，半透明，質(zhì)地松軟，增殖速度慢(圖1F);⑤形態(tài)同第一種愈傷組織，從褐化的愈傷組織中產(chǎn)生(圖1G)。其中①、⑤兩種愈傷組織，表面都有白色，透明絲狀組織，此時使用顯微鏡觀察，可看到表面產(chǎn)生透明的圓丘狀凸起(圖1H)。壓片后可見其主要由兩類細胞組成:一類為細胞質(zhì)濃、細胞體積較小的胚頭細胞;另一類為胚柄細胞，即由一些高度液泡化，并或多或少延長的細胞組成。在大多數(shù)胚形成的早期，胚分化成明顯的胚頭和胚柄，其中胚柄是由胚頭基部的分生組織細胞分裂、分化而成的，它對胚頭可提供結(jié)構(gòu)上的支持和營養(yǎng)物質(zhì)吸收的作用，也是合成生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和儲存一些產(chǎn)物的場所［13］。

基于對胚性愈傷組織細胞增殖分裂過程的觀察，推測胚性愈傷組織的增殖過程是從某些單個細胞的快速分裂開始，逐漸形成以該細胞為分裂中心的相對獨立的快速增殖的細胞團。顯微鏡下觀察到的細胞多呈大小相似的團狀，有序地聚集在一起。中心部位的細胞個體小，核質(zhì)比大，含線粒體較多，無液泡，處于快速分裂中，有時形成類似四分體的形狀，組織染色后可見。而外部細胞個體較大，胞質(zhì)中可見一些尚不成形的大液泡(圖1I～L)。胚性愈傷組織的活性可能與中心細胞的旺盛分裂能力有關(guān)?？焖僭鲋?、生長良好的愈傷組織(圖1M)中，可見較多緊密成團的中心細胞。部分褐化組織上仍可長出新的愈傷組織，很可能是由于該愈傷組織中保留了較多的分裂能力強的中心細胞。

在試驗中還觀察到一些胚的胚根部或子葉和胚軸連接處在培養(yǎng)過程中膨大并形成白色或淺綠色愈傷組織，經(jīng)觀察此種愈傷組織可直接產(chǎn)生胚狀體(圖1N)，即外植體不經(jīng)過愈傷階段而直接在表面形成胚狀體。

圖1 外植體誘導過程中的外觀和細胞組織

3 討論

吳子歡等［14］用思茅松成熟胚為外植體，誘導出了透明愈傷組織，但并未描述是否為胚性愈傷組織?，F(xiàn)有研究表明，雖然思茅松體胚發(fā)生途徑是其無性系造林最具優(yōu)勢和潛力的繁殖方式，還可為后續(xù)基因工程育種提供最佳遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)，但是，尚存在外植體取材范圍受限、取材時期短、胚性愈傷誘導率低、體細胞胚發(fā)育不整齊等亟需解決的問題。大量試驗表明，胚性愈傷組織的誘導及體胚發(fā)生過程都與外植體的生理狀態(tài)、培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分、生長調(diào)節(jié)因子以及多個胚在培養(yǎng)中競爭性等因素關(guān)系密切［15］。只有合子胚發(fā)育到一定時期，才對外界培養(yǎng)環(huán)境有反應，其發(fā)育程度對胚性愈傷組織的誘導起決定性作用［16］。通常認為分化程度較低的組織，如未成熟胚，更有利于體細胞胚胎的誘導發(fā)生［17］。但未成熟胚采集困難，受生長季節(jié)限制與地域限制較大，僅限于胚胎發(fā)育的某一時期才有較高誘導率，適宜外植體采集時間短且不好掌握。因此，本研究使用成熟胚作為外植體探索誘導胚性愈傷組織，是簡化操作、降低成本的有效方法，且此方法可在大規(guī)模生產(chǎn)中較為方便。

有研究認為，不同品種間以及同一品種不同基因型之間，對胚性愈傷組織的誘導及后期胚胎發(fā)育方面都有很大差異［18］。在試驗中，筆者發(fā)現(xiàn)有的胚性愈傷組織在增殖培養(yǎng)基上30 d不繼代，也不會褐化且生長良好。這些愈傷組織可被篩選出來大量擴增，建立增殖體系。故而在進一步的體系優(yōu)化研究中可從外植體的基因型篩選上進行較為系統(tǒng)的研究，以提高其后期的生長質(zhì)量。

試驗中多次發(fā)現(xiàn)，在誘導愈傷組織的過程中，外植體會產(chǎn)生抑制細菌生長的物質(zhì)，即培養(yǎng)基受細菌污染嚴重時，外植體周圍并無污染(圖1O)，但對真菌無效。可以對此物質(zhì)進行進一步的研究以期能開發(fā)出新型天然殺菌(細菌)劑。

在試驗過程當中觀察到直接體胚發(fā)生的現(xiàn)象。近年來不斷有松屬體胚發(fā)生體系建成的報道，但指的都是間接體胚發(fā)生，直接體胚發(fā)生與此相比，具有培養(yǎng)程序簡單、易操作和成功率高等特點，因此建立思茅松的直接體胚發(fā)生體系，是一個可深入探究的問題。

胚性愈傷組織誘導率較高，但愈傷組織產(chǎn)生較小且增殖緩慢，造成了后續(xù)工作的停滯，所以尋找有效的保持和增殖胚性愈傷組織的培養(yǎng)基，將是下一步工作中所急需解決的問題。

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