徐宗大 郝瑞杰 楊煒茹

(花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué))，北京，100083) (城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué)))

程堂仁 王佳 張啟翔

(國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心(北京林業(yè)大學(xué))) (城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué)))

責(zé)任編輯:任 俐。

花發(fā)育一直是觀賞植物研究的重點(diǎn)，前人通過(guò)擬南芥等模式植物的研究，提出了植物花器官發(fā)育的ABC模型、ABCE模型及四因子模型［1－3］。在擬南芥中，A功能基因包括APETALE1(AP1)和APETALE2(AP2)，它們控制著萼片和花瓣的發(fā)育［4］。其中AP2基因編碼屬于AP2/ERF家族的轉(zhuǎn)錄因子，除參與花分生組織建立和花器官發(fā)育外，AP2基因還調(diào)控了種子的發(fā)育［5－6］。此外，AP2基因在營(yíng)養(yǎng)器官中也有表達(dá)，但其突變體對(duì)營(yíng)養(yǎng)器官的表型沒(méi)有影響［7］。

梅花(Prunus mume Sieb．et Zucc．)是薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus)重要的觀賞花木與果樹(shù)，為中國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一。在長(zhǎng)期的栽培及人工育種過(guò)程中，梅花形成了單瓣、重瓣、臺(tái)閣、飛瓣、多萼片、多雌蕊等花型［8］。這些豐富的花型既增加了梅花的觀賞價(jià)值，也為研究植物花器官發(fā)育提供了良好的材料。然而，對(duì)梅花花器官發(fā)育基因的相關(guān)研究鮮見(jiàn)報(bào)道，梅花花發(fā)育的分子機(jī)理尤其是不同花型形成的機(jī)理尚不明確。鑒于AP2基因在植物花器官發(fā)育尤其是萼片和花瓣發(fā)育中具有重要的功能，本研究對(duì)梅花AP2基因進(jìn)行了克隆，并對(duì)其在梅花不同器官(營(yíng)養(yǎng)器官和花器官)、不同花型(單瓣、重瓣、臺(tái)閣)品種中的表達(dá)模式進(jìn)行研究，以期明確PmAP2基因在梅花花器官發(fā)育及花型形成中的功能，為通過(guò)分子生物學(xué)手段改良梅花花型奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2014年在花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué))進(jìn)行。以‘三輪玉蝶’(Prunus mume‘Sanlun Yudie’)花蕾為試材，提取總RNA用于基因克隆;取‘三輪玉蝶’根、莖、葉、萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊、未成熟果實(shí)等材料進(jìn)行基因的組織特異性表達(dá)分析;以單瓣品種‘江梅’(Prunus mume‘Jiangmei’)、重瓣品種‘三輪玉蝶’和臺(tái)閣品種‘素白臺(tái)閣’(Prunus mume‘Subai Taige’)的花蕾為材料，研究基因在不同花型梅花花蕾的表達(dá)差異。所有材料液氮速凍后－80℃保存。

總RNA提取及第一鏈cDNA合成:將試驗(yàn)材料在液氮中研成粉末后，采用百泰克公司的RNApure高純總RNA提取試劑盒提取總RNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測(cè)RNA質(zhì)量后，以2μg總RNA為模板，采用TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒合成第一鏈cDNA。操作方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

PmAP2基因克隆:以擬南芥AP2蛋白序列(NP_195410．1)為種子，在梅花基因組蛋白庫(kù)中進(jìn)行本地BLAST搜索，將同源性最高的序列作為候選基因。根據(jù)基因核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增基因的編碼區(qū)(CDS)。以梅花cDNA為模板進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，采用Promega Gel extraction kit DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，連接到pMD18－T(Takara)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，挑取陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR驗(yàn)證后，交由中美泰和生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

PmAP2基因序列分析:將克隆得到的序列提交到Interprto網(wǎng)站(https://www．ebi．a(chǎn)c．uk/interpro/)上進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析;采用DNAMAN軟件對(duì)PmAP2蛋白與其他物種AP2蛋白進(jìn)行比對(duì)分析;用EXPASy的ProtParam程序(http://web．expasy．org/protparam/)分析PmAP2蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)以及疏水性;將克隆得到的核苷酸序列提交到psRNATarget網(wǎng)站(http://plantgrn．noble．org/psRNATarget/?function=2)上進(jìn)行miRNA靶位點(diǎn)預(yù)測(cè);采用clustalX［9］進(jìn)行多序列比對(duì)，利用MEGA6軟件采用N－J方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)［10］，bootstrap值設(shè)為1 000次。

實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR:分別提取樣品的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為real－time RT－PCR的模板。反應(yīng)采用20μL體系，即cDNA 2μL，SYBR Premix Ex Taq(Takara)10μL，上下游引物(10μmol·L－1)各0．4μL，ddH2O 7．2μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s，60℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物特異性通過(guò)溶解曲線(xiàn)進(jìn)行確定，試驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。結(jié)果與分析采用2－ΔΔCt法，以梅花PP2A基因作為內(nèi)參基因［11］，引物序列見(jiàn)表1。

表1 梅花PmAP2基因克隆及表達(dá)所用引物序列

2 結(jié)果與分析

2．1 PmAP2基因的克隆與序列

以梅花花蕾cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序后，得到長(zhǎng)為1 647 bp的CDS序列(圖1)。BLAST分析表明，該基因與多種植物AP2基因有較高的同源性，其中與桃AP2基因的相似性最高，為96%，與蘋(píng)果AP2基因的相似性為82%。CDS編碼一個(gè)由548個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其相對(duì)分子質(zhì)量為57．75 kD，理論等電點(diǎn)為6．04，為親水性蛋白。Interpro分析表明，此蛋白含有AP2蛋白特有的兩個(gè)保守的AP2結(jié)構(gòu)域，并且在第一個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域上游有一個(gè)核定位信號(hào)，這些特征與其他物種AP2蛋白一致(圖1)［12－13］。將該基因命名為PmAP2，Genebank登錄號(hào)為KP405836。將得到的CDS序列提交到植物miRNA靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站psRNATarget進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)在3’端有一個(gè)miR172結(jié)合位點(diǎn)(圖1黑框中序列)，說(shuō)明PmAP2的表達(dá)可能受miR172的調(diào)控。

2．2 蛋白質(zhì)多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化

采用DNAMAN將得到的PmAP2蛋白與其他植物AP2蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，11種植物的AP2蛋白的一致性為50．81%。核定位信號(hào)、兩個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域(及其之間區(qū)域)、miRNA172結(jié)合位點(diǎn)這三部分序列在不同物種間保守性較高，而其余序列在不同物種間保守性較低(圖2)。核定位信號(hào)的同源性最高，所有植物的核定位信號(hào)序列均為KKSRRGPRSR。兩個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域之間的序列同源性也非常高，說(shuō)明這部分序列在連接兩個(gè)結(jié)構(gòu)域行使功能方面有重要作用。MiR172結(jié)合位點(diǎn)在比對(duì)的裸子植物(銀杏)、單子葉植物(玉米)和被子植物 AP2序列中都存在，且保守性也很高。

圖1 PmAP2基因CDS序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

為進(jìn)一步了解梅花與其他物種AP2蛋白的進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA6構(gòu)建了梅花與其他17種植物AP2蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，18種植物的AP2蛋白可以分為3組。兩種單子葉植物(小麥和玉米)單獨(dú)聚為一組;3種裸子植物:銀杏、黑松和歐洲云杉聚為一組;其余的雙子葉植物的AP2蛋白為一組。在雙子葉植物進(jìn)化枝中，梅花與另外兩種薔薇科植物桃和蘋(píng)果的親緣關(guān)系最近，這3種植物的AP2蛋白先聚為一組，然后與其他雙子葉植物的基因聚為一組。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)與物種進(jìn)化較為一致。

2．3 梅花AP2基因的表達(dá)模式

以梅花PP2A基因?yàn)閮?nèi)參，對(duì)PmAP2在不同組織(根、莖、葉、萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊、外/中(果皮)、內(nèi)果皮和種子)中的表達(dá)模式進(jìn)行了研究。如圖4a所示，PmAP2在梅花營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官中均有表達(dá)，說(shuō)明PmAP2廣泛參與到梅花各種器官的發(fā)育。PmAP2在花瓣中表達(dá)量最高，其次為雌蕊和內(nèi)果皮，而在營(yíng)養(yǎng)器官(根、莖、葉)中的相對(duì)表達(dá)量較低，說(shuō)明PmAP2在梅花生殖生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。

梅花的花型非常豐富，但關(guān)于這些花型形成的機(jī)理尚缺乏相應(yīng)的研究。鑒于AP2基因在花器官?zèng)Q定及花發(fā)育過(guò)程中有非常重要的作用，文中對(duì)PmAP2在單瓣、重瓣和臺(tái)閣梅花中的表達(dá)模式進(jìn)行了研究，以期為揭示梅花不同花型的形成機(jī)理奠定基礎(chǔ)。如圖4b所示，PmAP2在最原始的單瓣品種‘江梅’的表達(dá)量最低，而在花型最復(fù)雜的臺(tái)閣品種‘素白臺(tái)閣’的表達(dá)量最高，二者相差將近一倍(圖4b)。其在重瓣品種‘三輪玉蝶’中的表達(dá)量居中。這表明隨著花型復(fù)雜程度的增加，PmAP2的表達(dá)量呈上升的趨勢(shì)，PmAP2可能參與了梅花復(fù)雜花型的形成。

3 結(jié)束語(yǔ)

本研究從梅花花蕾中成功分離出花器官?zèng)Q定基因PmAP2。序列同源性分析表明該基因與其他薔薇科物種(桃和蘋(píng)果)AP2基因的同源性非常高。該基因編碼的蛋白具有AP2蛋白的典型特征:有兩個(gè)高度保守的AP2結(jié)構(gòu)域和一個(gè)完全保守的核定位信號(hào)［14］。這說(shuō)明此基因?qū)儆贏P2基因家族，且具有轉(zhuǎn)錄因子的特征。此外，蛋白序列同源性分析表明，除高度保守的兩個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域(及其之間序列)、核定位信號(hào)和miR172靶位點(diǎn)這三部分序列外，不同物種的AP2基因保守性較低，說(shuō)明AP2基因發(fā)生了種屬特異的進(jìn)化過(guò)程，從而導(dǎo)致不同物種AP2基因序列上的差異;而高度保守區(qū)域的存在說(shuō)明這些區(qū)域在AP2正常功能發(fā)揮方面有著重要的作用，因而在進(jìn)化過(guò)程中保存下來(lái)。例如，miR172靶位點(diǎn)在較原始的裸子植物(銀杏)、單子葉植物和雙子葉植物中都存在，說(shuō)明miR172調(diào)控AP2表達(dá)是一種原始的調(diào)控機(jī)制，并且在維持AP2正常功能方面發(fā)揮著重要的作用，因而在長(zhǎng)期的物種進(jìn)化中保存了下來(lái)。

圖2 梅花與其他物種AP2基因的多序列比對(duì)

圖3 梅花與其他物種AP2系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖4 PmAP2表達(dá)模式

在花器官發(fā)育的ABC模型中，AP2基因行使A類(lèi)基因的功能，參與了萼片和花瓣的決定。除此之外，兩個(gè)A類(lèi)基因(AP1和AP2)還參與了植物的成花轉(zhuǎn)變和早期的花序分生組織建立［1，15－16］。在擬南芥和其他物種中，AP2在四輪花器官及營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)組織中均有表達(dá)［6，13，17－19］。熒光定量PCR結(jié)果顯示，PmAP2在梅花營(yíng)養(yǎng)器官及四輪花器官中也均有表達(dá)，與前人研究結(jié)果基本一致［6，13，17－19］。花瓣的表達(dá)量最高，說(shuō)明AP2在花瓣發(fā)育中發(fā)揮重要的作用。Jofuku et al．［6］研究表明，AP2基因在擬南芥種子發(fā)育尤其是種皮的發(fā)育中發(fā)揮重要作用。矮牽牛的三個(gè)AP2基因在成熟的胚乳中高表達(dá)，但在胚中不表達(dá)［20］。本研究發(fā)現(xiàn)PmAP2在梅花外果皮、中果皮(果肉)和內(nèi)果皮的表達(dá)量都非常高，說(shuō)明PmAP2還參與了梅花果實(shí)的發(fā)育，AP2基因?qū)麑?shí)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制在不同物種中是相似的。此外，文中還研究了PmAP2在不同花型梅花中的表達(dá)模式，結(jié)果表明，隨著花型復(fù)雜程度的增加，PmAP2的表達(dá)量也在增加。這意味著AP2基因很可能參與了梅花復(fù)雜花型的形成。臺(tái)閣花型是梅花中比較奇特的一類(lèi)花型，是由于雌蕊被另外一朵花取代而形成的［21］。形態(tài)解剖表明，臺(tái)閣的上位花是在原本應(yīng)該分化雌蕊的位置分化出了萼片，進(jìn)而分化出完整的上位花。由此推測(cè)，很可能是在原本應(yīng)該C類(lèi)基因表達(dá)的部位，A類(lèi)基因特異表達(dá)，從而分化出上位花的萼片。因此，PmAP2在臺(tái)閣花型梅花中的大量表達(dá)可能與臺(tái)閣花上位花形成有關(guān)。

本研究克隆了梅花中的AP2基因，并對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步研究梅花花發(fā)育的調(diào)控機(jī)理及花型形成與進(jìn)化奠定了基礎(chǔ)。

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