蘇遠(yuǎn)科 張國(guó)林 李純鋼

沙門氏菌屬(salmonella)是一大群寄生于人類和動(dòng)物腸道內(nèi)，生化反應(yīng)和抗原構(gòu)造相似的革蘭氏陰性桿菌［1，2］。據(jù)統(tǒng)計(jì)在世界各國(guó)的種類細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。國(guó)內(nèi)外對(duì)食品中沙門氏菌的檢測(cè)技術(shù)或檢測(cè)方法研究并不鮮見［3-5］。這些方法大都都是對(duì)沙門氏菌的定性檢測(cè)但是對(duì)沙門氏菌定量研究很少。目前，僅有SN/T0040-1992是沙門氏菌定量方法，原理是基于MPN法實(shí)現(xiàn)定量。SN/T0040-1992雖然可以定量檢測(cè)但是缺點(diǎn)操作繁瑣，需要稀釋三個(gè)梯度或更多，每個(gè)梯度3管共9管，每個(gè)管都要進(jìn)行陰陽性判斷才能確定，耗時(shí)費(fèi)力，同時(shí)，該方法由于從225 ml 10倍樣品稀釋液中取1 ml用來增菌培養(yǎng)存在漏檢風(fēng)險(xiǎn)。本課題以腸炎沙門氏菌為例對(duì)沙門氏菌定量研究模型進(jìn)行探討，基于ELISA和細(xì)菌生長(zhǎng)曲線應(yīng)用的結(jié)合，研究沙門氏菌的定量，開發(fā)一種一種操作簡(jiǎn)單有效能夠?qū)悠分猩抽T氏菌本底含量檢測(cè)的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器:MiniVidas酶聯(lián)免疫分析儀制造商生物梅里埃，恒溫培養(yǎng)箱型號(hào)INE600制造商MEMMERT。

1.1.2 培養(yǎng)基:緩沖蛋白胨水(BP)海博生物批號(hào)20120509，亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)海博生物批號(hào)20120506，四硫磺酸鹽煌綠增菌液(TTB)海博生物批號(hào)20120309，亞硫酸鉍瓊脂(BS)海博生物批號(hào)20120417，DHL瓊脂海博生物批號(hào)20120315，3M菌落總數(shù)測(cè)試片規(guī)格型號(hào) PertrifilimTM 6406批號(hào)2013-10TP。

1.1.3 菌株:腸炎沙門氏菌株(salmonella enteritidis)3代，大腸桿菌(escherichia coli)3代(購(gòu)置中國(guó)工業(yè)菌種保藏中心)，奇異變形菌(P.mirabilis)2代(實(shí)驗(yàn)室分離獲得)

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株活化:以無菌操作將菌株濾紙片放入10 mm緩沖蛋白凍水試管中，36℃培養(yǎng)過夜;培養(yǎng)液劃線接種平板BS，DHL培養(yǎng)24～48 h;挑去單菌落接種到盛有20 ml BPW的試管中培養(yǎng)18 h備用。

1.2.2 菌液的梯度稀釋及計(jì)數(shù):10倍梯度稀釋菌液(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8)，分別將10-5、10-6、10-7、10-8稀釋液1 ml接種測(cè)試片，每個(gè)梯度接種2片，放入培養(yǎng)箱36℃培養(yǎng)24～48 h后計(jì)數(shù)。

1.2.3 酶聯(lián)免疫分析儀測(cè)試值(熒光值)與沙門氏菌濃度函數(shù)關(guān)系建立:腸炎沙門氏菌株純化后挑去單菌落接種于緩沖蛋白胨水中10～20 ml 36℃培養(yǎng)12～18 h，分別進(jìn)行10倍稀釋，5倍稀釋，4倍稀釋3倍稀釋和2倍稀釋。選取2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、1 000倍稀釋液使用Vidas檢測(cè)，同時(shí)使用3M細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)測(cè)試片對(duì)培養(yǎng)液10-5，10-6，10-7進(jìn)行計(jì)數(shù)。然后建立Vidas測(cè)試值與沙門氏菌濃度(取對(duì)數(shù)值)數(shù)學(xué)函數(shù)關(guān)系式。

1.2.4 沙門氏菌在兩種培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)曲線繪制:使用不同濃度沙門氏菌分別接種TTB(1、10、50、150、 380 cfu/ml)、SC(0.58、5.8、20、58、200、580 cfu/ml)增菌液100 ml于42℃和36℃培養(yǎng)間隔1或2 h取樣，使用測(cè)試片對(duì)沙門氏菌計(jì)數(shù)，培養(yǎng)至16～20 h。繪制不同接種濃度沙門氏菌在兩種培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 生長(zhǎng)曲線對(duì)人為污染樣品的檢測(cè):選用樣品常溫和冷鮮豬和雞肉25 g進(jìn)行人為污染，放入25 ml增菌液均質(zhì)1 min，然后加入剩下的200 ml增菌液置于36℃和42℃培養(yǎng)，分析建立的方法對(duì)人為污染樣本檢出的的誤差。

1.2.6 干擾試驗(yàn):選擇大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，變形桿菌作為干擾菌。設(shè)置兩組相同的樣品，第1組如同驗(yàn)證試驗(yàn)部分，只添加一定濃度的腸炎沙門氏菌到樣品中，第2組在第1組的基礎(chǔ)上添加干擾菌混合液包括大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，單增李斯特氏菌和變形桿菌，每種干擾菌的添加量均是目標(biāo)菌10倍以上。操作同驗(yàn)證試驗(yàn)部分，在SC增菌液中增菌10 h，使用vidas對(duì)增菌液檢測(cè)。每種干擾菌的添加量均是目標(biāo)菌10倍以上。操作同驗(yàn)證試驗(yàn)部分，在SC增菌液中增菌10 h，使用vidas對(duì)增菌液檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 vidas檢測(cè)值與菌濃度關(guān)系及驗(yàn)證 本文發(fā)現(xiàn)，Vidas測(cè)試值與沙門氏菌濃度(對(duì)數(shù)值)函數(shù)關(guān)系為y =0.102x3-0.648x2+1.563x+5.826，相關(guān)系數(shù)R2= 0.994，X值適應(yīng)范圍0.2～3.8，對(duì)應(yīng)沙門氏菌濃度范圍約106～108cfu/ml，即vidas對(duì)沙門氏菌檢測(cè)底限約在106cfu/ml，而菌濃度超過108cfu/ml會(huì)出現(xiàn)x值鈍化狀態(tài)，可能與抗原抗體結(jié)合飽和有關(guān)。取經(jīng)過一系列稀釋梯度的腸炎沙門氏菌液6管分別對(duì)其進(jìn)行vidas檢測(cè)和使用3 M測(cè)試片計(jì)數(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)。通過驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，vidas檢測(cè)計(jì)算值與測(cè)試片所得值相對(duì)誤差最小0.13%，最大2.50%，平均相對(duì)誤差1.33%。見圖1、表1。

2.2 腸炎沙門氏菌在TTB和SC中生長(zhǎng)曲線的建立我們比較腸炎沙門氏菌若干梯度在sc增菌液36℃培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)曲線對(duì)數(shù)期的中后期培養(yǎng)8～10 h是進(jìn)行vidas檢測(cè)較好時(shí)機(jī)，而vidas最佳檢測(cè)區(qū)間在沙門氏菌濃度在106cfu/ml到108cfu/ml，這時(shí)各梯度生長(zhǎng)曲線區(qū)分度分較好，進(jìn)入平穩(wěn)期曲線則近于粘合。橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間(h)縱坐標(biāo)我們發(fā)現(xiàn)腸炎沙門氏菌在TTB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線的對(duì)數(shù)期要短些，培養(yǎng)12 h后基本進(jìn)入穩(wěn)定期。其中接種1 cfu/ml為例經(jīng)過2 h的調(diào)整期進(jìn)入對(duì)數(shù)期，經(jīng)過約14 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，不同接種濃度沙門氏菌在調(diào)整期都是2 h，不

圖1 Vidas測(cè)試值橫坐標(biāo)與菌濃度縱坐標(biāo)(取對(duì)數(shù)值)函數(shù)關(guān)系

表1 驗(yàn)證試驗(yàn)中通過vidas檢測(cè)得到數(shù)值代入公式計(jì)算值與實(shí)測(cè)值對(duì)比分析

同的是濃度越高對(duì)數(shù)期時(shí)間越短更早的進(jìn)入穩(wěn)定期。見圖2、3。

圖2 腸炎沙門氏菌若干稀釋梯度在SC增菌液36度培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線

圖3 腸炎沙門氏菌若干稀釋梯度在TTB增菌液42度培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線

2.3 通過生長(zhǎng)曲線對(duì)人為污染樣品的檢測(cè) 本文發(fā)現(xiàn)，在SC增菌液中，冷鮮豬肉模擬樣品相對(duì)誤差較大，其余樣本誤差均在10%以內(nèi);在TTB增菌液中，冷鮮豬肉模擬樣品相對(duì)誤差在28.6%，而其他樣本誤差均在10.0%以內(nèi)。見表2～5。

2.4 干擾實(shí)驗(yàn) 本文發(fā)現(xiàn)，干擾試驗(yàn)中對(duì)含有干擾菌的樣品檢測(cè)與不含干擾菌的檢測(cè)誤差平均值為0.17，相對(duì)誤差平均值在11.0%。見表6。

表2 加入系列濃度沙門氏菌的人為污染樣品在sc增菌液中增菌9 h后vidas檢測(cè)

表3 實(shí)際添加腸炎沙門氏濃度和檢測(cè)值比較分析 %

表4 加入系列濃度沙門氏菌的人為污染樣品在TTB增菌液中增菌9 h后vidas檢測(cè)

表5 實(shí)際添加腸炎沙門氏濃度和檢測(cè)值比較分析

表6 第1組樣品和第2組添加干擾菌的樣品的增菌液初始沙門氏菌濃度估算cfu/ml

3 討論

沙門氏菌是影響食品安全的主要微生物之一。沙門氏菌病是公共衛(wèi)生學(xué)上重要的人畜共患病之一，沙門氏菌引起的食物中毒在各國(guó)細(xì)菌性食物中毒中常列榜首，現(xiàn)有規(guī)定中食品中不得檢出沙門氏菌［6，7］。但是目前食品中沙門氏菌的定量檢測(cè)方法相對(duì)較少，且存在諸多的不足。本課題對(duì)鮮肉及制品中腸炎沙門氏菌定量檢測(cè)研究，基于沙門氏菌在選擇性增菌液中的生長(zhǎng)曲線。選擇性增菌液對(duì)干擾菌會(huì)有一定的抑制作用，同時(shí)還能促進(jìn)沙門氏菌的生長(zhǎng)，這樣能夠更好的對(duì)目標(biāo)菌的分離。通過生長(zhǎng)曲線可以看出，無論接種濃度大小，都經(jīng)歷2 h停滯期(適應(yīng)期)然后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期隨著接種菌濃度增加而縮短，進(jìn)過培養(yǎng)9～16 h不同接種濃度沙門氏菌基本上都到達(dá)平穩(wěn)期菌含量在(5～8)×108cfu/ml。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期不同接種濃度沙門氏菌形成斜率基本相同的平行斜線，如在SC增菌液中對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)曲線斜率在0.71～0.73。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期某一定時(shí)間不同接種濃度的沙門氏菌增殖達(dá)到濃度形成一定斜率的直線，如SC增菌中培養(yǎng)9 h時(shí)得出方程y=1.028X-5.202相關(guān)系數(shù)R2=0.995，根據(jù)此方程和此時(shí)增菌液沙門氏菌濃度x可以計(jì)算出增菌液初始接種濃度。本文中使用vidas對(duì)增菌液濃度檢測(cè)根據(jù)檢測(cè)值與菌濃度數(shù)學(xué)模型y=0.102x3-0.648x2+1.563x+5.826相關(guān)系數(shù)R2=0.994(0.2＜x＜3.8)因?yàn)関idas檢測(cè)底限在106cfu/ml此時(shí)檢測(cè)值接近0.2，此方法在10 h時(shí)檢測(cè)限在2 cfu/ml附近。但是如果使用熒光定量PCR檢出限100 cfu/ml，能夠定量到1 cfu/100 ml［8-10］。

本方法是對(duì)鮮肉類及制品直接使用SC或TTB增菌根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)SN/T0040-1992出口食品沙門氏菌屬(包括亞利桑那菌)計(jì)數(shù)檢驗(yàn)方法。本使用腸炎沙門氏菌為模型進(jìn)行的研究，如果擴(kuò)展到其他類型沙門氏菌還需要具體探索其他菌在SC或TTB中的生長(zhǎng)模型。同時(shí)，本文探索基于ELISA-生長(zhǎng)曲線原理來對(duì)沙門氏菌定量研究的方法，也可擴(kuò)展到對(duì)其他菌的定量研究。

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