米麗麗 楊大運(yùn) 顧瀟 王云平 王弘 陳曉娜 齊站

肺癌是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康與生命的惡性腫瘤之一，局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是肺癌患者治療和預(yù)后較差的最主要影響因素。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)和基底膜的降解被認(rèn)為是腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在這一過(guò)程中，E-鈣黏附素(E-cadherin)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2)起著重要的作用。作為鈣依賴(lài)性細(xì)胞黏附分子的E-cadherin，在保持組織結(jié)構(gòu)完整性和上皮細(xì)胞形態(tài)及極性上具有重要作用，其表達(dá)減少或缺失可降低細(xì)胞間的黏附功能，是EMT事件發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。具有降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜作用的MMP-2，可以使腫瘤新生血管生成，并引起腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)利用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)E-cadherin和MMP-2在肺癌及癌旁正常肺組織中的表達(dá)情況，探討兩者與NSCLC臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院胸外科2010年8月至2011年8月確診為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung canc-er，NSCLC)標(biāo)本138例。取相應(yīng)的癌旁正常肺組織78例作為對(duì)照。所有石蠟標(biāo)本均經(jīng)切片、HE染色，明確病理診斷。其中男96例，女42例;年齡31～78歲，中位年齡62歲;鱗癌92例，腺癌46例;高分化癌49例，中分化癌43例，低分化癌 46例。肺癌分期采用IASLC/UICC公布的第7版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)(2009年)，Ⅰ期41例(Ⅰa19例，Ⅰb 22例)，Ⅱ期35例(Ⅱa 16例，Ⅱb 19例)，Ⅲ期39例(Ⅲa 25例，Ⅲb 14例)，Ⅳ期23例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者58例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移80例。均未行放療或化療。

1.2 試劑 兔抗人E-cadherin和鼠抗人MMP-2單克隆抗體為美國(guó)Santa Cruz公司生產(chǎn)，SP免疫組化試劑盒以及DAB顯色試劑盒由福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 方法 切除標(biāo)本常規(guī)進(jìn)行10%甲醛固定石蠟包埋，制備4 μm組織切片，脫蠟脫苯和水化，鏈霉素抗生物素蛋白過(guò)氧化物酶法檢測(cè)E-cadherin及MMP-2蛋白表達(dá)。陽(yáng)性對(duì)照切片由試劑公司提供，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照。每張切片隨機(jī)挑選10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，對(duì)其中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)后計(jì)算出其平均值。(1)根據(jù)細(xì)胞深淺對(duì)染色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)評(píng)分:陰性0分，淡黃色1分，黃棕色2分，棕色者3分;(2)陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)分級(jí):＜5%記0分，5% ～25%記1分，26% ～50%記2分，51%～75%記3分，＞75%記4分，取(1)、(2)評(píng)分的乘積計(jì)算總分:若總分≤1為陰性，＞1為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，免疫組化結(jié)果與臨床病理關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，E-cadherin和MMP-2蛋白表達(dá)相關(guān)性應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 E-cadherin和MMP-2在正常肺組織及癌組織中的表達(dá) E-cadherin在肺癌組織及正常肺組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為28.99%(40/138)和66.67%(52/ 78)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。MMP-2在肺癌組織及正常肺組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為59.42% (82/138)和29.49%(23/78)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖1、2。

2.2 E-cadherin和MMP-2蛋白表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系 在肺癌組織中，E-cadherin和MMP-2蛋白表達(dá)均與肺癌的分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)。而與患者的性別、年齡、吸煙史以及腫瘤瘤體大小、病理類(lèi)型無(wú)顯著性相關(guān)(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 肺癌組織中E-cadherin和MMP-2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系例

2.3 E-cadherin和 MMP-2蛋白表達(dá)的關(guān)系Spearman等級(jí)相關(guān)性分析顯示，在 NSCLC組中，E-cadherin和 MMP-2的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r= -5.670，P=0.017)。見(jiàn)表2。

表2 肺癌中E-cadherin與MMP-2表達(dá)的相關(guān)性 例

3 討論

E-cadherin是鈣依賴(lài)性跨膜糖蛋白，具有介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間相互黏附的功能，該基因定位于人染色體16q22.1，有16個(gè)外顯子，分子量120 kD，廣泛分布于人體組織的上皮細(xì)胞中。在病理情況下，E-cadherin能使腫瘤細(xì)胞間保持密切接觸，阻止瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶進(jìn)入周?chē)M織和脈管系統(tǒng)，被認(rèn)為是一個(gè)重要的抑癌基因。EMT是腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，而E-cadherin表達(dá)減少或缺失是EMT事件發(fā)生的標(biāo)志。有研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin在多種腫瘤組織中表達(dá)下降［1-5］。

本研究結(jié)果顯示，癌旁正常肺組織中，E-cadherin在肺泡上皮細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為66.67%，在NSCLC中，E-cadherin的陽(yáng)性表達(dá)率為28.99%，E-cadherin在癌組織中的表達(dá)明顯低于正常肺組織，提示E-cadherin在NSCLC發(fā)生中扮演著重要角色。E-cadherin表達(dá)和肺癌分化程度相關(guān)，分化程度越低E-cadherin的陽(yáng)性表達(dá)率越低。這表明E-cadherin的表達(dá)水平是非小細(xì)胞肺癌分化的標(biāo)志。E-cadherin還與腫瘤的臨床分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及術(shù)后生存期有關(guān)，分期越晚，表達(dá)水平越低，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，E-cadherin的表達(dá)水平下降，并且患者的生存期縮短。提示E-cadherin表達(dá)下調(diào)或缺失，使腫瘤細(xì)胞間的黏附性喪失，腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)腫瘤灶，獲得在體內(nèi)擴(kuò)散的能力，從而發(fā)生肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移。

腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多階段多步驟的復(fù)雜病理過(guò)程，在這一過(guò)程中，基質(zhì)和基底膜的降解是非常重要的環(huán)節(jié)，其中MMPs發(fā)揮了十分關(guān)鍵的作用。MMP-2是一種Zn2+依賴(lài)性蛋白水解酶，相對(duì)分子質(zhì)量為72 kD，MMP-2能特異性降解基質(zhì)膜中的Ⅳ型膠原，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2在多種腫瘤組織中表達(dá)下降［6-8］。

本研究結(jié)果顯示，在癌旁正常肺組織中，MMP-2的陽(yáng)性表達(dá)率為29.49%，在NSCLC中，MMP-2的陽(yáng)性表達(dá)率為59.42%，MMP-2在癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常肺組織。肺癌的分化程度越低，臨床分期越晚，MMP-2的表達(dá)水平越高;發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，MMP-2的表達(dá)水平增高，并且患者的生存期縮短。提示MMP-2表達(dá)上調(diào)在肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2可以下調(diào) E-cadherin，誘發(fā)EMT，而使腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移增加［9-12］。本研究結(jié)果顯示肺癌組織MMP-2蛋白表達(dá)顯著高于正常肺組織，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著低于正常肺組織，MMP-2及E-cadherin蛋白表達(dá)與肺癌組織學(xué)分級(jí)、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示MMP-2表達(dá)上調(diào)及E-cadherin表達(dá)下調(diào)在肺癌發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮作用。另外，對(duì)MMP-2及E-cadherin蛋白表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析結(jié)果提示兩者可能存在相互拮抗的作用，但其調(diào)控機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)MMP-2及E-cadherin在NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中均起著非常重要的作用，聯(lián)合檢測(cè)二者可為肺癌診斷、靶向治療和預(yù)后預(yù)測(cè)提供一定的依據(jù)。

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