賈建麗 蔡勁松 戚翔 楊幼明 閆靜 李雪 徐雪

缺血性腦血管疾病是一種發(fā)生于中老年的常見病 和多發(fā)病，其發(fā)病率、病死率、致殘率和復發(fā)率均很高，并且有上升趨勢和年輕化趨勢。如何防治腦缺血再灌注損傷，減輕腦缺血再灌注損傷，尋求一種合適有效的治療藥物及措施，一直是臨床各科室所關注的問題。對于既往存在缺血性腦血管疾病的患者實施手術，麻醉過程中的腦保護問題尤為重要，可以最大程度地減少圍術期腦血管意外情況的發(fā)生。右美托咪定(DEX)是一種新型高效高選擇性的α2腎上腺素能受體激動劑，有鎮(zhèn)靜、抗焦慮、鎮(zhèn)痛、抑制交感神經、明顯減少麻醉藥的用量和穩(wěn)定血流動力學等特點，且呼吸抑制作用?。?］。因其獨特的藥理特性在臨床麻醉的特殊治療領域:喚醒麻醉［2］、困難氣道［3］、兒童用藥［4］等方面顯示出來極大的優(yōu)越性，基礎研究已證實DEX對腦缺血再灌注損傷具有一定保護作用［5，6］，但預先給藥是否具有腦保護作用，筆者未見報道。本研究以此為切入點，研究不同劑量DEX預先給藥是否具有腦保護作用，且是否具有劑量依賴性。旨在進一步為臨床用藥提供有力的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠40只，月齡3～3.5個月，體重 280～350 g，合格證號: 1303097，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。實驗前，所有動物均在安靜清潔的實驗室喂養(yǎng)2～3 d以適應實驗室環(huán)境，室溫23℃，12 h間隔照明，以標準大鼠營養(yǎng)飼料喂養(yǎng)，任其自由進食水。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備:10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔麻醉成功后，采用Pulsinelli-Brierley等［7］的四血管閉塞改良法建立大鼠全腦缺血再灌注模型。大鼠清醒后放回單獨的鼠籠飼養(yǎng)。動物存活24 h后，不行麻醉將其仰臥位固定于鼠板上，頸部正中切口，長約3 cm，鈍性分離頸部肌肉，暴露雙側頸總動脈，用1～0的細絲線穿過頸總動脈備用。尾靜脈穿刺置管，接微量泵以備輸入DEX或0.9%氯化鈉溶液。采用無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側頸總動脈，造成動物全腦缺血，15 min后松開動脈夾，恢復腦血流灌注，模型制備成功的標志為血流阻斷后1 min內大鼠的意識喪失，翻正反射及對光反射消失，瞳孔散大，顏色蒼白，呼吸加快，在整個缺血期內維持不變?；謴脱鞴嘧⒑?，瞳孔顏色立即變成鮮紅色，瞳孔縮小至正常水平，意識漸漸恢復，翻正反射恢復，并在整個再灌注期內維持不變。S組:假手術組，僅接受手術而不遭受全腦缺血打擊，術中予持續(xù)靜脈泵注0.9%氯化鈉溶液2 h，輸注速度2 ml/h。C組:缺血再灌注對照組，全腦缺血15 min后再灌注30 min，在全腦缺血前2 h予以持續(xù)靜脈泵注0.9%氯化鈉溶液2 h，輸注速度2 ml/h。D1組:DEX低劑量組，全腦缺血前2 h予以DEX首次劑量(6 μg/kg)10 min內靜脈輸注，剩余劑量以0.05 μg·kg-1·min-1持續(xù)靜脈泵注2 h，輸注速度2 ml/h(DEX用0.9%氯化鈉溶液稀釋)。D2組:DEX中劑量組，全腦缺血前2 h予以DEX首次劑量(60 μg/kg)10 min內靜脈輸注，剩余劑量以0.5 μg·kg-1·min-1持續(xù)靜脈泵注2 h，輸注速度2 ml/h(DEX用0.9%氯化鈉溶液稀釋)。

1.2.2 全腦缺血模型的建立:采用Pulsinelli-Brierley等的四血管閉塞改良法建立大鼠全腦缺血再灌注模型。大鼠清醒后放回單獨的鼠籠飼養(yǎng)。

1.2.3 腦組織含水量測定:模型制備成功，大鼠再灌注30 min后，每組隨機取4只，立即斷頭取腦，在冰浴中剝出大腦，左側大腦行腦組織含水量測定。4組實驗動物在缺血再灌注30 min后，立即斷頭取腦，取左側大腦用萬分之一的電子分析天平稱濕重后，置入110°C恒溫干燥箱烤干至恒重(2次稱重差別＜0.2 mg)后，用同一電子天平再精確稱干腦組織重量，并按照eliot干濕重法計算腦組織含水量，以百分率表示。腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重× 100%。

1.2.4 病理檢測:模型制備成功，大鼠再灌注30 min后，每組隨機取4只，先快速輸入0.9%氯化鈉溶液200～300 ml進行心臟灌注，繼而以4℃ 4%的多聚甲醛固定液(pH值7.4，0.1 mol/L PB配置)300～400 ml進行心臟灌注，30～60 min完成灌注。開顱取腦，左右兩側大腦分別置入4℃4%的多聚甲醛中和4%的戊二醛中備病理、電鏡檢測。

1.2.5 光鏡標本采集:擬行光鏡檢測標本，于視交叉后緣每隔2 mm平行作3個冠狀切面，取2片2 mm厚的腦組織于4%多聚甲醛固定液中再固定24 h，經常規(guī)梯度脫水、透明、浸蠟包埋，切片厚為5 μm。行蘇木紫-伊紅染色。

1.2.6 透射電子顯微鏡觀察:擬行電鏡檢測標本，冰盤上迅速選取海馬CA1區(qū)組織，按“快、小、輕、準”的原則取材，以鋒利刀片于視交叉后4 mm冠狀切開右側腦組織，切取海馬CA1區(qū)標本3～4塊，大小為1 mm ×1 mm×1 mm。經固定、清洗、梯度脫水、浸透、包埋、聚合后，超薄切片機切厚約40 nm的切片，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色電子染色后應用JEM-1230(日本)透射電鏡拍片，觀察神經元、星形膠質細胞、線粒體、高爾基體等超微結構的變化。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料正態(tài)分布數(shù)據(jù)以±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，并進行方差齊性檢驗，如方差不齊則采用秩和檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 4組大鼠體重和月齡比較 4組大鼠的體重、月齡差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 4組大鼠體重和月齡比較 n=10，±s

表1 4組大鼠體重和月齡比較 n=10，±s

組別 體重(g) 月齡(月) S組311±24 3.28±0.20 C組 314±24 3.25±0.16 D1組 325±20 3.32±0.15 D2組316±23 3.29±0.22

2.2 DEX預先給藥對大鼠全腦缺血再灌注損傷后腦水含量的影響 腦組織水含量的測定結果表明，與S組比較，C組、D1組、D2組大鼠腦組織含水量明顯升高(P均＜0.05);與C組比較，D1組、D2組大鼠腦組織含水量差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表2。

表2 4組大鼠缺血再灌注后腦組織含水量變化n=5，%，±s

表2 4組大鼠缺血再灌注后腦組織含水量變化n=5，%，±s

注:與S組比較，*P＜0.05

組別 腦組織含水量S組79.11±0.26 C組 80.15±0.61* D1組 80.04±0.46* D2組 79.87±0.77*

2.3 DEX預先給藥對大鼠全腦缺血再灌注神經病理觀察 S組海馬CA1區(qū)錐體細胞層神經元有3～4層，排列整齊緊密，細胞界限清晰，胞核呈圓形或橢圓形，淡染，占整個細胞的2/3，有1～2個核仁，呈圓形，深染;C組海馬CA1區(qū)錐體細胞排列散亂，大量錐體細胞核水腫，透明，少數(shù)細胞體積變小成三角形，核濃縮深染，結構消失;D1組、D2組較C組腦組織病變輕，多數(shù)錐體細胞存活，固縮神經元數(shù)量及神經元缺失明顯減少。

2.4 DEX預先給藥對大鼠全腦缺血再灌注后4組海馬CA1區(qū)神經元超微結構的影響

2.4.1 S組:神經元細胞核呈圓形或橢圓形，核膜清楚，核仁清晰;胞質內細胞器正常，線粒體形態(tài)不一，線粒體嵴清晰規(guī)則，高爾基體囊泡排列規(guī)則;毛細血管內皮細胞及星形細胞正常。

2.4.2 C組:神經細胞周圍可見明顯水腫帶，胞質水腫，線粒體電子密度增高，腫脹，嵴斷裂、減少、或消失，高爾基體囊泡擴張;星形細胞明顯腫脹;毛細血管內皮細胞腫脹，管周明顯水腫。見圖1。

圖1 C組超微結構變

2.4.3 D1組:神經細胞周圍仍可見水腫，但較C組減輕;線粒體電子密度增高，腫脹，高爾基體囊泡擴張;星形細胞腫脹較C組減輕;毛細血管周圍可見水腫。見圖2。

圖2 D1組超微結構變化

2.4.4 D2組:神經細胞周圍仍可見水腫，但較C組減輕;線粒體電子密度增高，略腫脹，高爾基體囊泡略擴張;星形細胞略腫脹;毛細血管周圍水腫。見圖3。

3 討論

大鼠全腦缺血再灌注動物模型的建立方法有很多種，常見的有兩血管阻斷伴低血壓模型、沙土鼠兩血管阻斷法、Pulsinelli等［7］的四血管阻斷法、頸動脈分流動物模型等。其中，四血管阻斷法全腦缺血再灌注動物模型在國內使用較多，它的解剖學基礎在于大鼠腹側脊髓動脈有一定向腦干的返支，四血管阻斷期間可以維持腦干的血液供應，使大鼠在一定時間內能夠存活下來。其優(yōu)點是缺血效果確切，操作相對簡單，實驗重復性好，可較好的模擬臨床上因心臟驟停、嚴重低血壓休克、心肺腦復蘇等所致的缺血性腦損傷過程，這是本研究采用此模型的依據(jù)。

圖3 D2組超微結構變化

血腦屏障將中樞神經系統(tǒng)和血液系統(tǒng)隔離開來，防止血漿中對腦組織有毒性作用的物質進入腦內，維持中樞神經系統(tǒng)的功能正常。血腦屏障破壞后導致血液中毒性物質進入腦內，離子平衡失調引起腦水腫，通常腦組織含水量增加的多少，反映腦組織水腫程度［8］。腦缺血再灌注后繼發(fā)的腦水腫，會降低腦的灌注壓，損害毛細血管和增大氧氣從血液彌散到細胞的距離，從而進一步加重原有的腦缺血病變。腦組織含水量測定是反映腦水腫的重要指標:腦水腫時腦組織含水量增加，腦含水量的高低直接反映腦水腫的嚴重程度，同時也可反映腦細胞的損傷程度。本實驗顯示于對照組C組比較，D1、D2組腦組織含水量有降低趨勢，但未顯示出統(tǒng)計學差異，可能與標本量較少有關。

大鼠短暫性全腦缺血模型以前腦缺血為主，前腦缺血的病理性變化可累及大腦皮層、紋狀體、杏仁核、丘腦、下丘腦、海馬、中腦、嗅球等區(qū)域，病理性檢測結果是評價缺血性腦損傷的金標準。海馬是缺血性腦損傷最易感的組織之一，海馬在低倍鏡下呈“C”形，分為CA1、CA2、CA3、CA4四個區(qū)，短暫性全腦缺血模型以CA1區(qū)對缺血最為敏感，CA3區(qū)對缺血有較好的耐受。本實驗主要對CA1區(qū)超微結構進行觀察。研究結果表明S組CA1區(qū)有3～4層椎體細胞，排列緊密整齊，高倍鏡下可見椎體細胞核大而圓、淡染，有1～2個核仁，超微結構下觀察，S組椎體細胞核大而圓，核仁明顯，染色質密度均一，線粒體、高爾基體等細胞器豐富，星形細胞正常。C組全腦缺血15 min后再灌注30 min，CA1區(qū)損傷嚴重，失去正常結構，椎體細胞排列散亂，大量椎體細胞變性，核固縮，椎體細胞明顯減少，僅殘存極少量形態(tài)相對完好的神經元。超微結構下可見神經細胞周圍水腫明顯，胞質水腫，線粒體電子密度增高，腫脹，嵴斷裂、減少、甚至消失，高爾基體囊泡擴張，毛細血管內皮細胞腫脹，管周明顯水腫，星形細胞明顯腫脹。D1組神經細胞周圍腫脹、星形細胞腫脹較C組減輕。D2組線粒體雖電子密度仍顯增高，但腫脹較C組減輕。通過超微結構變化可以看出全腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)對缺血刺激敏感的神經元、星形膠質細胞、細胞器在對照組顯示出明顯的損傷改變，細胞器中以線粒體的改變最為明顯，表現(xiàn)為電子密度增高、嵴斷裂或缺失。分析原因可能是由于缺血改變勢必會導致缺氧性改變，而線粒體由于其特殊的結構和功能最易受缺氧的影響，即受到活性氧的攻擊。線粒體DNA(mtDNA)分布于線粒體內膜周圍，臨近活性氧產生的部位，且由于其周圍沒有組織蛋白的保護，即缺乏相關的DNA修復酶，極易受到活性氧的攻擊而損傷［9］。正常情況下細胞內同時存在有效的抗氧化防御機制，如呼吸鏈的自我凈化、各種抗氧化酶、DNA修復系統(tǒng)等，可以及時清除線粒體有氧代謝過程中產生活性氧，使其保持在極低水平，因此很少受到它的傷害。但在一些病理狀態(tài)下，如缺血再灌注損傷發(fā)生后活性氧生成過多過快或者機體抗氧化功能的降低，使線粒體及細胞發(fā)生受損，表現(xiàn)為線粒體腫脹、畸形、空泡形成等，說明線粒體受到了較嚴重的損害。D1、D2組可見線粒體嵴的破壞程度減輕、正常線粒體增多，可見經右美托咪定預先給藥后，上述超微結構中細胞水腫減輕、線粒體腫脹減輕，血管源性水腫和細胞毒性水腫得到緩解產生了從而產生了一定的保護作用。

綜上所述，全腦缺血再灌注損傷大鼠，低劑量組和中劑量組右美托咪定預先給藥均可產生有一定的腦保護作用，表現(xiàn)腦組織水腫減輕，超微結構細胞器腫脹減輕但2組之間未顯示出顯著差異。

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5 張曉青，賈建麗，徐雪.右美托咪定減輕大鼠全腦缺血再灌注損傷.基礎醫(yī)學與臨床，2013，33:117-118.

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7 Pulsinelli W，Brierley J.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat.Stroke，1979，10:267-272.

8 Iadecola C，Alexander M.Cerebral ischemia and inflammation.Curr Opin Neurol，2001，14:89-94.

9 宋今丹主編.醫(yī)學細胞分子生物學.第1版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2003.203-229.