李堂林，翁治委(綜述)，周少虎(審校)

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，廣州 510405)

生殖系統(tǒng)氧化應(yīng)激損傷的動物實(shí)驗(yàn)方法研究進(jìn)展

李堂林△，翁治委△(綜述)，周少虎※(審校)

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，廣州 510405)

活性氧類(reactive oxygen species，ROS)是機(jī)體正常新陳代謝過程中產(chǎn)生的一組具有比氧氣更強(qiáng)氧化能力的含氧活性物質(zhì)的統(tǒng)稱。在正常精液的新陳代謝過程中，活性氧與精液抗氧化系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)，當(dāng)精液中ROS生成過多或抗氧化系統(tǒng)相對貧乏時,產(chǎn)生的ROS不能及時清除，導(dǎo)致ROS蓄積，便形成氧化應(yīng)激。

目前，生殖系統(tǒng)氧化應(yīng)激損傷的評估大多數(shù)以精液常規(guī)參數(shù)——精液濃度、精子活力及精子形態(tài)為基礎(chǔ)，并結(jié)合生化檢測如氧自由基、谷胱甘肽、丙二醛、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase，GST)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)以及精子DNA完整性等綜合評價(jià)。

現(xiàn)階段，生殖系統(tǒng)氧化應(yīng)激研究及學(xué)說尚未完全成熟，尤其是在國內(nèi)，相關(guān)研究報(bào)道較少。動物實(shí)驗(yàn)是研究病理生理機(jī)制及藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方面不可或缺重要手段，現(xiàn)對近年來研究精液氧化應(yīng)激的動物實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行歸納，以期為臨床研究提供基礎(chǔ)。

1重金屬污染物

1.1鎘鎘是一種重金屬，生殖器官睪丸、卵巢對鎘損傷非常敏感。鎘對氨基酸的硫醇基特別是半胱氨酸有較強(qiáng)的親和力，可導(dǎo)致谷胱甘肽水平下降，脂質(zhì)過氧化增加、細(xì)胞間穩(wěn)定性改變、DNA和細(xì)胞膜損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[1-2]。

腹腔注射或胃腸道接觸氯化鎘均可造成生殖系統(tǒng)氧化應(yīng)激損傷。使用氯化鎘(1 mg/kg)單次維斯塔大鼠腹腔注射，56 d后發(fā)現(xiàn)精液受到氧化應(yīng)激損傷[1]。氯化鎘(1 mg/kg)連續(xù)腹腔注射SD大鼠3 d，可增加脂質(zhì)過氧化物標(biāo)志物硫代巴比妥酸反應(yīng)物(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)的水平，降低SOD、CAT、GPx及谷胱甘肽的水平，從而形成急性氧化應(yīng)激狀態(tài)[2]。

給予維斯塔大鼠氯化鎘大劑量(30 mg/kg)口服，每周5次，連續(xù)8周，可導(dǎo)致睪丸組織形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞凋亡增加，丙二醛活性增強(qiáng)，抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性降低,造成生殖系統(tǒng)氧化應(yīng)激損傷[3]。

1.2鎳鎳是日常生活中經(jīng)常接觸到的一種金屬，廣泛存在于生活的各個方面。鎳的毒性作用與其引起的氧化應(yīng)激有關(guān)：小鼠腹腔注射不同劑量的氯化鎳(0.625、1.250、2.500、5.000 μmol/100 g)，連續(xù)3 d或5 d，可在中、高劑量組形成氧化應(yīng)激損傷[4]。不同實(shí)驗(yàn)動物對鎳所造成的氧化應(yīng)激損傷的敏度性有所差異，以5 mg/kg的氯化鎳分別對大鼠和小鼠進(jìn)行腹腔注射，48 h后僅觀察到小鼠的精漿發(fā)生氧化應(yīng)激損傷[5]。

2香煙煙霧暴露

香煙的煙霧包含大量有害物質(zhì),如尼古丁、一氧化碳、致癌物質(zhì)以及致突變物質(zhì)等，這些物質(zhì)或其代謝產(chǎn)物均可出現(xiàn)在精漿中，并引起生殖毒性，進(jìn)而導(dǎo)致精子質(zhì)量下降。香煙煙霧暴露(每日20支，以30 min 10只的速度，間隔10 min)連續(xù)9 d可造成精液氧化應(yīng)激：丙二醛和硫醇基(-SH)水平增加、SOD活性增強(qiáng)，精子濃度、活力、活率及正常形態(tài)均降低，精子DNA碎片率增加[6]。

3有機(jī)工業(yè)污染物

3.1四溴聯(lián)苯醚四溴聯(lián)苯醚是多溴聯(lián)苯醚的一種，是一種有害的有機(jī)環(huán)境污染物，其被廣泛用于紡織品、家具及電子產(chǎn)品等生產(chǎn)中。給予SD大鼠四溴聯(lián)苯醚[0.001、0.03、1 mg/(kg·d)]灌胃，每周連續(xù)6 d，連續(xù)8周后使用熒光免疫檢驗(yàn)法發(fā)現(xiàn)，大鼠精液中ROS的水平明顯升高，且氧化應(yīng)激程度與四溴聯(lián)苯醚用藥濃度呈正相關(guān)[7]。

3.2溴氰菊酯溴氰菊酯是合成除蟲菊酯類殺蟲劑的一種，其被廣泛用于農(nóng)業(yè)殺蟲。溴氰菊酯1 mg/kg大鼠腹腔注射連續(xù)21 d，可造成精漿一氧化氮和丙二醛水平增加、精子DNA完整性損害、細(xì)胞凋亡增加，形成氧化應(yīng)激損傷睪丸組織[8]。

3.3四氯二苯并二惡英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)TCDD是一種高毒性的環(huán)境有機(jī)污染物，其具有生殖、發(fā)育毒性，內(nèi)分泌、代謝毒性及致癌性等。SD大鼠口服TCDD每周 2 μg/kg，連續(xù)45 d，精液中SOD、GSH、CAT、GPx的水平明顯降低，附睪精子密度、活力下降，精子畸形率增加，并認(rèn)為TCDD通過結(jié)合并激活細(xì)胞溶質(zhì)中的抗透明質(zhì)酸酶而激活酶樣細(xì)胞色素P4501A1，從而引起精液氧化應(yīng)激[9]。

3.4乙二醇乙基醚(ethylene glycol monoethyl ether，EGEE)EGEE具有慢性生殖和血液毒性。給予雄性維斯塔大鼠EGEE(100、200、400 mg/kg)口服，連續(xù)14 d后，200 mg/kg和400 mg/kg組維斯塔大鼠睪丸、附睪中GSH水平降低，SOD、CAT活性下降，丙二醛、GST、LDH水平增加，病理檢查證實(shí)睪丸退化[10]。

4脂多糖

脂多糖是革蘭陰性菌死亡后釋放的一種內(nèi)毒素，大鼠腹腔注射脂多糖(5 mg/kg)24 h后即可引起睪丸生精功能障礙，睪丸內(nèi)丙二醛、一氧化氮水平增加，DNA損傷標(biāo)志物8-羥基脫氧鳥苷水平升高，還原型谷胱甘肽和LDH-x水平降低，進(jìn)而導(dǎo)致睪丸組織損傷、精子數(shù)量和活力降低[11]。脂多糖腹腔注射后能通過免疫反應(yīng)擾亂血-睪屏障，增加白細(xì)胞滲透性，導(dǎo)致精液中白細(xì)胞增多，進(jìn)而產(chǎn)生過多的ROS，并激活一氧化氮合酶[11]。

體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，成年大鼠的Sertoli細(xì)胞與脂多糖(5、10、20 μg/mL)一起孵育后，過氧化氫生成增加，抗氧化酶和谷胱甘肽水平明顯下降，從而形成氧化應(yīng)激狀態(tài)并損傷Sertoli細(xì)胞功能(乳酸鹽產(chǎn)物增多、LDH、γ谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶、β葡糖醛酸糖苷酶活性下降)，且損傷程度與脂多糖劑量呈正相關(guān)[12]。

5氫過氧化物

目前，用于動物生殖系統(tǒng)氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)的過氧化氫物主要有叔丁基氫過氧化氫(t-butyl hydroperoxide，tbHP)、過氧化氫枯烯(cumene hydroperoxide，cHP)和過氧化氫3種。tbHP可作為生物體內(nèi)多個系統(tǒng)氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)劑[13]。tbHP在小鼠內(nèi)以1∶10 半數(shù)致死量(median lethal dose,LD50)腹腔注射連續(xù)2周，睪丸和精液中O2-和H2O2的水平明顯升高，精子數(shù)量及活力降低，睪丸萎縮、曲細(xì)精管中精子減少[14]。tbHP造成的氧化應(yīng)激可能是tbHP導(dǎo)致谷胱甘肽水平降低所致。SD大鼠腹腔注射H2O21 mg/kg，隔日1次，連續(xù)10周，精液中GST水平明顯升高，精子活力和精卵結(jié)合功能受損(胰蛋白酶降低)、生精受到抑制(人肌動蛋白素2升高)、精子凋亡增加(親環(huán)蛋白A升高)；蛋白質(zhì)合成損傷(熱激蛋白升高)[15]。氫過氧化物造成的氧化應(yīng)激具有劑量-時間依賴性：維斯塔大鼠腹腔單次(1/40、1/20、1/10 LD50)注射氫過氧化物(tbHP和cHP)并不能造成大鼠睪丸和附睪內(nèi)的氧化應(yīng)激損傷，但連續(xù)腹腔注射1或2周能導(dǎo)致大鼠睪丸、附睪內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，且氧化應(yīng)激程度與氫過氧化物劑量呈正比[16]。

在體外，維斯塔大鼠睪丸細(xì)胞組織懸液和睪丸外植組織與氫過氧化物(tbHP和cHP，濃度：100 μmol/L)共孵育，可造成睪丸細(xì)胞組織懸液和睪丸外植組織脂質(zhì)過氧化顯著增加，抗氧化酶(CAT和GPx)活性抑制，谷胱甘肽水平降低，且氧化應(yīng)激程度與共同孵育時間和藥物濃度呈正相關(guān)[17]。

6內(nèi)分泌激素

6.1炔雌醇炔雌醇通過引起睪丸內(nèi)氧化應(yīng)激損傷，打亂睪丸細(xì)胞增殖與凋亡的平衡，擾亂性類固醇分泌，引起生精紊亂。SD大鼠口服炔雌醇3 mg/(kg·d)，連續(xù)14 d，可形成精液氧化應(yīng)激損傷，精子數(shù)量及活力降低，Sertoli細(xì)胞和生精細(xì)胞數(shù)量減少、排列紊亂，精子凋亡增加[18]。

6.2瘦素瘦素是脂肪組織產(chǎn)生的一種激素，其在生殖系統(tǒng)能量平衡和新陳代謝中具有重要作用。SD大鼠腹腔注射瘦素(10、30 μg/kg)連續(xù)7 d或15 d，可造成精子ROS和精子DNA碎片增加，精子常規(guī)參數(shù)下降[19]。

6.3男性避孕藥AdjudinAdjudin是一種不影響男性激素分泌的男性避孕藥，其通過阻礙生精細(xì)胞的生長而達(dá)到避孕的目的。維斯塔大鼠口服Adjudin 40 mg/kg，在短期內(nèi)(4～7 d)即可造成睪丸內(nèi)氧化應(yīng)激損傷，表現(xiàn)為過氧化氫量和脂質(zhì)過氧化增加，SOD、CAT、GPx、GPS等抗氧化酶活性降低；但長時間(15～30 d)應(yīng)用，氧化應(yīng)激則不明顯[20]。

7鏈脲霉素

維斯塔大鼠單次腹腔注射鏈脲霉素(60 mg/kg)，可造成大鼠睪丸、附睪中TBARS、丙二醛水平升高，GSH、維生素E、CAT、GPx、谷胱甘肽還原酶、SOD水平降低，睪丸組織損傷，該損傷在腹腔注射后2周開始出現(xiàn)，并呈持續(xù)性[21]。

8右腎靜脈部分阻斷

精索靜脈曲張是造成男性不育的原因之一，其通過引起生殖系統(tǒng)組織缺氧而造成氧化應(yīng)激損傷[22]。

右腎靜脈部分阻斷可造成SD大鼠精索靜脈曲張模型。右腎靜脈部分阻斷4周后可造成生殖系統(tǒng)氧化應(yīng)激損傷：睪丸組織內(nèi)丙二醛水平增加，GPx、SOD活性明顯降低，一氧化氮水平明顯增加；病理檢查發(fā)現(xiàn)睪丸生精損傷，血清ROS升高[23]。氧化應(yīng)激可能通過破壞血-睪屏障而造成生殖系統(tǒng)損傷[24]。

血管阻斷時間決定氧化應(yīng)激造模的成敗。對維斯塔大鼠右腎實(shí)施靜脈部分阻斷術(shù)30 d后，采用光澤精探針化學(xué)發(fā)光法檢測發(fā)現(xiàn)，右側(cè)睪丸內(nèi)ROS明顯升高，細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加[25]。使用睪丸動脈和腎靜脈夾閉法造成睪丸局部短期缺血(夾閉1 h后恢復(fù)血供24 h)，睪丸內(nèi)精子受損但并不形成氧化應(yīng)激[26]。

9脊髓損傷

Padron等[27]在人體發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷可導(dǎo)致精液氧化應(yīng)激損傷。Wang等[28]對SD大鼠進(jìn)行脊髓損傷造模并檢測發(fā)現(xiàn)，大鼠精液濃度及活力下降，精液中的白細(xì)胞和畸形精子增多，認(rèn)為精液質(zhì)量下降系氧化應(yīng)激所致。

10檳榔果提取物

檳榔子的生物堿成分——檳榔堿具有生殖毒性。以檳榔果提取物的水溶液連續(xù)灌胃(100 mg/kg)45 d可造成大鼠睪丸、附睪內(nèi)丙二醛水平升高，CAT活性增強(qiáng)，過氧化氫清除劑——唾液酸水平降低，精子數(shù)量及活力降低，畸形精子率增加[29]。

11鈣離子通道阻滯劑

12手機(jī)輻射暴露

移動手機(jī)是現(xiàn)代生活必不可少的，先前的研究發(fā)現(xiàn)，高頻輻射暴露可導(dǎo)致精子數(shù)量和活力降低，細(xì)胞凋亡增加[31]，而導(dǎo)致這些改變的原因可能與高頻輻射引起生殖系統(tǒng)內(nèi)氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

雄性維斯塔鼠手機(jī)輻射暴露0.9 W/kg，2 h/d，連續(xù)45 d，即發(fā)現(xiàn)睪丸、附睪內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激損傷：睪丸內(nèi)胱天蛋白酶3活性明顯增加，蛋白激酶C明顯下降，精子總數(shù)和細(xì)胞凋亡明顯增加，脂質(zhì)過氧化、過氧化氫酶活性增加，GSH、GPx水平降低[32-33]。

13年齡

隨年齡的增長，線粒體呼吸鏈功能不全，氧自由基增多[34]，抗氧化酶水平下降[35]，從而形成氧化應(yīng)激。老年棕色挪威大鼠精液的抗氧化酶GPx、SOD活性降低，GR活性輕度增加[36]。老齡維斯塔大鼠精液中脂質(zhì)過氧化增多，HO-、H2O2產(chǎn)生增加，抗氧化酶與非酶抗氧化物水平均降低，精子活力明顯下降[37]，證明老年大鼠生殖系統(tǒng)內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致生殖系統(tǒng)功能下降。

14結(jié)語

不育癥是臨床男科常見的疾病之一，男性精液異常是導(dǎo)致男性不育癥的主要原因，而精神靜脈曲張、附性腺感染、免疫性因素、睪丸下降不全、梗阻性因素、創(chuàng)傷以及先天性疾病等均可導(dǎo)致精液異常。近年來，氧化應(yīng)激被公認(rèn)為造成男性不育的主要原因之一，其從微觀角度詮釋了精子質(zhì)量的損害。影響精液氧化應(yīng)激的因素非常廣泛，Lavranos等[38]對現(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)的損害因素進(jìn)行了歸納，包括物理源：放射、高溫；化學(xué)源：藥物、毒素、吸煙及重金屬；生物源：糖尿病、感染等，并從病理生理學(xué)角度認(rèn)為ROS是引起人體各個系統(tǒng)多種疾病發(fā)生的重要原因：從生殖系統(tǒng)不育癥到神經(jīng)系統(tǒng)，甚至引起人體衰老等。目前，氧化應(yīng)激學(xué)說仍處于發(fā)展階段，尚未完全完善，其中仍存在不少爭議，尤其是在抗氧化應(yīng)激治療方面。因此，氧化應(yīng)激仍需進(jìn)一步研究探索。

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摘要：氧化應(yīng)激損傷通過影響精子濃度、降低精子活力、破壞精子DNA完整性、改變精子形態(tài)、加速精子凋亡等途徑影響精液質(zhì)量，最終導(dǎo)致男性不育。近年來，生殖系統(tǒng)的氧化應(yīng)激損傷受到男科醫(yī)師的廣泛關(guān)注。為闡明氧化應(yīng)激損傷對生殖系統(tǒng)損傷的作用機(jī)制，研究人員已開展了大量的臨床及動物實(shí)驗(yàn)研究。該文總結(jié)近年來研究生殖系統(tǒng)氧化應(yīng)激損傷所用到的動物實(shí)驗(yàn)方法，以期為以后的男性不育癥研究提供參考。

關(guān)鍵詞：男性不育癥；氧化應(yīng)激；活性氧類；動物實(shí)驗(yàn)

Advances of Animal Experimental Methods of Oxidative Stress in Reproductive SystemLITang-lin,WENGZhi-wei,ZHOUShao-hu.(DepartmentofReproductiveMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510405,China)

Abstract：Oxidative stress(OS) influences the quality of semen by decreasing sperm concentration, reducing motility of sperm,changing spermatozoa forms and accelerating spermatozoa apoptosis,finally leading to infertility.In recent years,OS in the reproductive system has been highly concerned.In order to explore the mechanism of OS damage of reproduction system,a lot of clinical and animal experiments have been developed.Here is to summarize the animal experimental methods in the research of OS in reproductive system in recent years,so as to provide a reference for the subsequent studies of male infertility.

Key words：Male infertility; Oxidative stress; Reactive oxygen species; Animal experiment

收稿日期：2014-03-20修回日期：2014-08-08編輯：辛欣

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.06.012

中圖分類號：R339.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)06-0991-04