單鐵英，單鐵強(qiáng)，岳 峰，袁 征，王 芳，王雪丹，鄭海萍，董永杰，周進(jìn)朝，李桂英△

（1.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，河北邯鄲056002；2.河北省秦皇島市海港醫(yī)院檢驗(yàn)科 066000；3.河北省邯鄲市中心醫(yī)院普外科，河北邯鄲056002；4.河北省邯鄲市永年縣第二醫(yī)院普外科 056002）

直腸癌是我國(guó)消化道腫瘤中最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)生率僅次于胃癌和食管癌，近年來(lái)由于人們的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，它的發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)，同時(shí)發(fā)病年齡也趨向年輕化，因此對(duì)于直腸癌的發(fā)生發(fā)展的研究引起廣大醫(yī)學(xué)者的興趣。研究表明，分化抑制因子2（inhibitors of differentiation 2，Id-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達(dá)水平與直腸癌的發(fā)生發(fā)展存在著密切的關(guān)系。本研究主要觀察在人直腸癌組織中Id-2和MMP-9的表達(dá)情況，分析兩者表達(dá)水平的相關(guān)性，探討直腸癌臨床病理學(xué)指標(biāo)與兩者表達(dá)水平的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010年1月1日至2011年9月1日來(lái)自邯鄲市中心醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的原發(fā)性直腸癌組織標(biāo)本56例，其中男44例，女12例。年齡33～75歲，中位年齡55歲。所有標(biāo)本中均以直腸癌組織的中心組織為直腸癌組織，以距癌腫5cm 的組織為癌旁正常組織。根據(jù)第7版腫瘤TNM 分期（國(guó)際抗癌聯(lián)盟和美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)合作制訂），對(duì)直腸癌進(jìn)行分期：56例患者中，11例為Ⅰ期，15 例為Ⅱ期，17 例為Ⅲ期，13例為Ⅳ期。采用2000年WHO 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)直腸癌組織學(xué)分型：33例為高、中等分化，23例為低等分化。24例患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，32例患者無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。所有斷端組織均未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞。所有病例取材前均未接受化學(xué)治療及放射治療。上述患者均無(wú)異常病史如糖尿病及糖耐量等?；颊叩臉?biāo)本經(jīng)病理科確診。

1.2 主要試劑 鼠抗人Id-2、鼠抗人MMP-9多克隆抗體以及SP免疫組織化學(xué)試劑盒均購(gòu)自北京中衫金橋生物有限公司，DAB顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物有限公司。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 Id-2染色結(jié)果的判斷 Id-2陽(yáng)性細(xì)胞表示為：細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)出染色為棕黃色的細(xì)顆粒。結(jié)果的判斷以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的多少和細(xì)胞染色強(qiáng)度的高低為依據(jù)并采用半定量積分的方法來(lái)表示，染色強(qiáng)度計(jì)分：0分為無(wú)色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占的比例計(jì)分：0分為無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞，1 分 為 小 于 或 等 于25%，2 分 為26%～50%，3 分 為51%～75%，4分為大于或等于76%。上述二者計(jì)分的乘積：陰性（-）為0分，弱陽(yáng)性（＋）為1～3分，中陽(yáng)性（＋＋）為4～8分，強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋）為9～12分。

1.3.2 MMP-9染色結(jié)果判定方法 結(jié)果判斷MMP-9蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，陽(yáng)性染色為細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)出棕黃色或黃褐色的顆粒，根據(jù)染色細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的百分比計(jì)分：陰性（-）為無(wú)細(xì)胞染色；弱陽(yáng)性（＋）為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)小于20%；中陽(yáng)性（＋＋）為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)21%～50%；強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋）為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)大于50%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS14.0軟件分析和處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間的比較采用χ2檢驗(yàn)，兩種蛋白的表達(dá)水平有無(wú)相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Id-2 在各組織中的表達(dá)情況 在大部分直腸癌組織標(biāo)本中可見(jiàn)Id-2著色呈棕黃或棕褐色，位于細(xì)胞質(zhì)中，陽(yáng)性細(xì)胞較多且呈彌散分布；癌旁正常組織標(biāo)本中也可見(jiàn)著色，但是陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較少且染色較淺呈淺黃色，散在分布于間質(zhì)；癌旁正常組織中陽(yáng)性表達(dá)極少（見(jiàn)圖1）。在直腸癌組織和癌旁正常組織中Id-2的陽(yáng)性表達(dá)率分別為73.21%和48.21%；在癌旁正常組織中Id-2的陽(yáng)性表達(dá)率比在直腸癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝13.077，P＜0.05），見(jiàn)表1。

圖1 Id-2 在癌旁正常組織及直腸癌中的表達(dá)（×400）

表1 Id-2 在直腸癌及癌旁正常組織中的表達(dá)

2.2 MMP-9 在各組織中的表達(dá)情況 在大部分直腸癌組織標(biāo)本中可見(jiàn)MMP-9著色呈棕黃或者棕褐色，位于細(xì)胞質(zhì)中，陽(yáng)性細(xì)胞較多且呈彌散分布；癌旁正常組織標(biāo)本中也可見(jiàn)著色，但是陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較少且染色較淺呈淺黃色，散在分布于間質(zhì)；癌旁正常組織中陽(yáng)性表達(dá)極少（見(jiàn)圖2）。在直腸癌組織和癌旁正常組織中MMP-9 的陽(yáng)性表達(dá)率分別為71.43%和44.64%；在癌旁正常組織中的MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率比直腸癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝13.875，P＜0.05），見(jiàn)表2。

圖2 MMP-9在癌旁正常組織及直腸癌中的表達(dá)（×400）

表2 MMP-9在直腸癌及癌旁正常黏膜中的表達(dá)

2.3 相關(guān)性分析 Spearman 相關(guān)分析表明Id-2 與MMP-9在癌旁正常組織和直腸癌組織中的陽(yáng)性率存在正相關(guān)性（r＝0.393，P＝0.003），見(jiàn)表3。

表3 Id-2 和MMP-9在癌旁正常組織和直腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

2.4 直腸癌的臨床病理指標(biāo)與腫瘤細(xì)胞中Id-2 和MMP-9蛋白表達(dá)水平的關(guān)系

2.4.1 直腸癌的臨床病理指標(biāo)與Id-2表達(dá)水平的關(guān)系 在56例直腸癌組織中Id-2的表達(dá)水平均升高，其中低分化組的Id-2陽(yáng)性表達(dá)率（91.30%）明顯高于中、高分化組（60.61%）；Ⅲ～Ⅳ期組（90.00%）明顯高于Ⅰ～Ⅱ期組（53.85%）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（91.67%）明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（59.38%）。以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但是在直腸癌組織中Id-2的陽(yáng)性表達(dá)率與患者的性別、發(fā)病年齡之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表4。

表4 Id-2的表達(dá)與不同直腸癌臨床病理因素的關(guān)系

2.4.2 直腸癌的臨床病理指標(biāo)與MMP-9表達(dá)水平的關(guān)系 在56例直腸癌組織中MMP-9的表達(dá)水平均升高，其中低分化組的MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率（86.96%）明顯高于中、高分化組（60.61%）；Ⅲ～Ⅳ期 組（86.67%）明 顯 高 于Ⅰ～Ⅱ期 組（53.85%）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（87.50%）明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（59.38%），以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但是在直腸癌組織中MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)率與患者的性別、發(fā)病年齡之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表5。

表4 MMP-9的表達(dá)與不同直腸癌臨床病理因素的關(guān)系

3 討 論

Id-2是一種在細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，作為Id蛋白家族成員之一，它也具有螺旋-環(huán)-螺旋（helix-loophelix，HLH）的結(jié)構(gòu)。Id-2分子參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟、分化及死亡等過(guò)程，還參與調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程。隨后發(fā)現(xiàn)在不同種類(lèi)的組織發(fā)育與腫瘤發(fā)展中Id-2 蛋白表現(xiàn)出多種作用：如參與胚胎發(fā)生和器官形成，腫瘤的浸潤(rùn)、分化、侵襲轉(zhuǎn)移行為及不良預(yù)后等功能［1-2］。目前已發(fā)現(xiàn)Id-2蛋白在多種惡性腫瘤組織如神經(jīng)母細(xì)胞瘤［3］、乳腺癌［4］、鼻咽癌［5］、膀胱癌［6］中過(guò)表達(dá)，因此人們?nèi)找嬷匾暺湓谀[瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及意義。本研究顯示：直腸癌組織中Id-2的陽(yáng)性表達(dá)率比癌旁正常組織的陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與上述文獻(xiàn)的研究結(jié)果一致，表明Id-2的異常高表達(dá)可能與直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

研究表明，有關(guān)Id-2蛋白與腫瘤的分化程度、腫瘤的侵襲和浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤的預(yù)后等的研究，其結(jié)果不完全相同，甚至還有矛盾的結(jié)果。Coppe等［7］研究表明Id-2蛋白表達(dá)增多能使腫瘤細(xì)胞變得更有侵襲性。Itahana等［8］在研究乳腺癌與Id-2表達(dá)的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，把Id-2基因?qū)隨Cp2鼠上皮細(xì)胞中后，細(xì)胞的增殖明顯減慢。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在侵襲性高、分化低的乳腺癌細(xì)胞中Id-2 mRNA 的表達(dá)水平明顯高于侵襲性低、分化高的乳腺癌細(xì)胞。Schindl等［9］應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)在早期宮頸癌組織中檢測(cè)Id-2蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示Id-2表達(dá)水平則與宮頸癌的預(yù)后無(wú)關(guān)。本研究結(jié)果也表明，Id-2在直腸癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織。在分化低、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的直腸癌組織中Id-2的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于分化高、Ⅰ～Ⅱ期和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的直腸癌組織，而在年齡和性別方面Id-2的陽(yáng)性表達(dá)率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

MMP-9屬于水解酶的一種，它能對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜成分進(jìn)行降解，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲到身體的其他部位，從而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展。研究表明，MMP-9在許多腫瘤組織中，如顱內(nèi)動(dòng)脈瘤［10］、胃癌［11］、乳腺癌［12］等組織中均有不同程度的陽(yáng)性表達(dá)。本研究結(jié)果表明：癌旁正常組織中MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于其在直腸癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率；在分化低、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的直腸癌組織中MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于分化高、Ⅰ～Ⅱ期和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的直腸癌組織，而在年齡和性別方面MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

本研究還顯示Id-2表達(dá)與MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)，直腸癌與癌旁正常組織中Id-2蛋白表達(dá)及MMP-9蛋白表達(dá)均存在差異。同時(shí)還觀察到Id-2與MMP-9的表達(dá)部位一致，提示直腸癌組織中Id-2高表達(dá)可能是通過(guò)MMP-9途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移起促進(jìn)作用?？梢酝茰y(cè)，在腫瘤的演進(jìn)發(fā)展過(guò)程中，Id-2與MMP-9的高表達(dá)起著協(xié)同作用。在直腸癌發(fā)生早期，Id-2基因已發(fā)生改變，使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、細(xì)胞增殖、分化失控和侵襲轉(zhuǎn)移，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)也可能促進(jìn)MMP-9的轉(zhuǎn)錄和功能，MMP-9蛋白的表達(dá)也升高，對(duì)腫瘤細(xì)胞周?chē)幕|(zhì)和基底膜成分進(jìn)行降解，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，又進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展。在這個(gè)過(guò)程中Id-2是通過(guò)何種信號(hào)途徑來(lái)上調(diào)MMP-9水平，其機(jī)制尚不清楚，有待于進(jìn)一步的研究。

總之，Id-2的異常高表達(dá)可能在直腸癌演變過(guò)程中對(duì)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲起著重要的作用，其機(jī)制可能是通過(guò)激活MMP-9的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)MMP-9的表達(dá)，直接或間接地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲作用。因此，Id-2可能為抗腫瘤治療提供了新的靶點(diǎn)。

［1］ Norton JD.ID helix-loop-helix proteins in cell growth，differentiation and tumorigenesis［J］.J Cell Sci，2000，113（Pt 22）：3897-3905.

［2］ Onken MD，Ehlers JP，Worley LA，et al.Functional gene expression analysis uncovers phenotypic Switch in aggressive uveal melanomas［J］.Cancer Res，2006，66（9）：4602-4609.

［3］ Paolella BR，Havrda MC，Mantani A，et al.p53directly represses Id2to inhibit the proliferation of neural progenitor cells［J］.Stem Cells，2011，29（7）：1090-1101.

［4］ Wazir U，Jiang WG，Sharma AK，et al.The mRNA expression of inhibitors of DNA binding-1and-2is associated with advanced tumour stage and adverse clinical outcome in human breast cancer［J］.Anticancer Res，2013，33（5）：2179-2183.

［5］ Liu Z，Chen J，Luo W，et al.Overexpressed DNA-binding protein inhibitor 2as an unfavorable prognosis factor promotes cell proliferation in nasopharyngeal carcinoma［J］.Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2012，44（6）：503-512.

［6］ Luo M，Li Z，Wang W，et al.Upregulated H19contributes to bladder cancer cell proliferation by regulating ID2expression［J］.FEBS J，2013，280（7）：1709-1716.

［7］ Coppe JP，Itahana Y，Moore DH，et al.Id-1and Id-2proteins as molecular markers for human prostate cancer progression［J］.Clin Cancer Res，2004，10（6）：2044-2051.

［8］ Itahana Y，Singh J，Sumida T，et al.Role of Id-2in the maintenance of a differentiated and noninvasive phenotype in breast cancer cells［J］.Cancer Res，2003，63（21）：7098-7105.

［9］ Schindl M，Oberhuber G，Obermair A，et al.Overexpression of Id-1protein is a marker for unfavorable prognosis in early-stage cervical cancer［J］.Cancer Res，2001，61（15）：5703-5706.

［10］ 門(mén)中華.VEGF 和MMP-9在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中的表達(dá)及臨床意義［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2010，26（11）：1126-1128.

［11］ 陳健，齊菲，黃瑩，等.MMP-9基因多態(tài)性與胃癌關(guān)系的研究［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，40（12）：2329-2333，2336.

［12］ 夏慶安，付玉環(huán)，姜廣建.HSG、MMP-2 和MMP-9 在乳腺癌組織中的表達(dá)及意義［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2012，39（2）：323-324，327.