池海超，陳 覓，張 杰

（中國人民武裝警察部隊湖北省總隊醫(yī)院耳鼻喉科，武漢430060）

過敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是呼吸系統(tǒng)常見的、多發(fā)的一種疾病，不僅嚴重地危害了人們身體健康而且容易誘發(fā)多種疾病［1］。AR 主要是患者吸入變應原，炎癥介質(zhì)的釋放，導致鼻黏膜發(fā)生炎癥［2］。同時發(fā)病原因也和體質(zhì)、遺傳、免疫等因素息息相關［3］。AR 的臨床表現(xiàn)主要有鼻塞、流鼻涕、鼻癢、打噴嚏及嗅覺功能障礙等。此外，它還可能導致或并發(fā)鼻竇炎、鼻息肉、咽炎、中耳炎、氣管和支氣管炎、哮喘和變應性眼結(jié)膜炎等疾病，嚴重影響人們的睡眠、學習、工作及生活質(zhì)量［4-5］。AR 主要通過藥物進行治療，存在安全性方面的問題，同時伴發(fā)較多不良反應［6］。有研究證明嗜酸乳酸桿菌（lacto-bacillus acidophilus，LBA）能夠通過調(diào)劑免疫反應預防或減輕過敏性癥狀，對臨床上AR的防治有深遠意義［7-8］。但免疫調(diào)節(jié)機制尚未十分清楚，本研究擬建立AR大鼠模型，通過乳酸桿菌對模型大鼠組織中ICAM-1及血清中組胺、白細胞介素（IL）-5、IL-12的影響，探討乳酸桿菌對AR大鼠免疫調(diào)節(jié)作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要儀器及試劑 SPF 級雄性SD 大鼠48只，揚州大學實驗動物中心提供，體質(zhì)量200～220g。LBA 濃縮凍干粉，有效活菌數(shù)大于或等于100億個／g，購自廣東金辛醫(yī)藥科技有限公司。卵清蛋白（ovalbumin，OVA）購自上海化學試劑廠。氯雷他定片（borata dine tablets，LRD）10 mg／片，購自上海先靈葆雅制藥有限公司。氫氧化鋁［Al（OH）3］購自上海凌峰化學試劑有限公司；組胺、白細胞介素-5（IL-5）、IL-12試劑盒購自上海恒遠生物科技有限公司；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶、上下游引物由上海生工生物科技有限公司生產(chǎn)或合成。BCA 蛋白濃度測定盒購自杭州碧云天生物技術(shù)研究所；ICAM-1一抗、山羊抗大鼠二抗、ECL發(fā)光顯色液購自美國Millipore公司。其他試劑均為分析純。

1.2 分組及造模 將48只雄性SD 大鼠分為4組：對照組、模型組、LBA 組、氯雷他定（LRD）組，每組12只。LBA 組每天按照2mL／kg灌服配制好的LBA 混懸液；對照組、模型組、LRD組每天灌服等量生理鹽水，連續(xù)灌服3周。第4周，按照參考文獻方法［8］，具體方法為：模型組、LBA 組、LRD 組大鼠以OVA 10mg、Al（OH）330mg及生理鹽水1mL混合后腹腔注射，隔天1次，連續(xù)7次，進行初次免疫；第15天進行激發(fā)，每天給予5% OVA 20μg滴鼻／側(cè)和1%OVA 噴霧吸入5min，連續(xù)7d。對照組同期使用無菌生理鹽水進行假致敏及假激發(fā)。

1.3 給藥方法 LBA 組按照2mL／kg大鼠體質(zhì)量灌服配制好的LBA 混懸液，造模期間同時給藥直到實驗結(jié)束；LRD 組于造模激發(fā)每天滴鼻前按照5mg／kg大鼠體質(zhì)量灌服生理鹽水溶解的LRD，每天1次，連續(xù)給藥7d。對照組與模型組灌服等體積生理鹽水。

1.4 癥狀評分標準 最后一次給藥2h后對大鼠進行癥狀評分，評分標準如下［9］。鼻癢：無搔鼻為0分，輕度搔鼻1～5次為1分，中度搔鼻6～10 次為2 分，重度搔鼻11 次以上為3分；噴嚏：無噴嚏為0分，1～5次為1分，6～10次為2分，11次以上為3分；清涕：無清涕為0分，以溢至鼻孔為1分，明顯流涕超出鼻孔為2 分，涕流滿面及掛滿須毛為3 分。并計算總分。

1.5 血清組胺、IL-5、IL-12水平檢測 最后一次給藥2h后，0.8%戊巴比妥鈉（0.5 mL／100g）腹腔注射麻醉。頸動脈取血，10min 3 500r／min取上清，于-80 ℃保存。酶聯(lián)免疫吸附法測定血清組胺、IL-5、IL-12水平。

1.6 ICAM-1mRNA 和蛋白表達檢測 取鼻中隔黏膜，采用Trizol試劑盒進行總RNA 的提取，經(jīng)核酸測定儀檢測RNA濃度并定量。采用兩步法進行反轉(zhuǎn)錄。ICAM-1上游引物：5′-AAG TGC TGC CGT CTC TAC AGT-3′；下游引物：5′-AGA GAC AGC GGT GGC TAA CT-3′。以GAPDH 為內(nèi)參，并計算相對灰度值。將鼻黏膜組織嚴格按照蛋白抽提試劑盒進行抽提。BCA 法蛋白定量。蛋白免疫印跡法（Western blot）方法：配制12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離膠，每孔蛋白30μg。電泳80V20min，135V40 min。電轉(zhuǎn)：250mA 90min。取出膜，封閉2h、一抗4℃過夜、二抗2h。ECL發(fā)光顯色，曝光。用目的蛋白的灰度值與內(nèi)參（GAPDH）的灰度值比值作用目的蛋白的相對表達量。

1.7組織病理檢測 取新鮮鼻黏膜組織甲醛固定，乙醇梯度脫水，包埋、切片、蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡觀察。按照參考文獻進行評分［10］。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，多組間兩兩比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 癥狀評分比較 與對照組比較，模型組大鼠鼻癢、噴嚏、清涕等3項評分及總分顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，LVA 組與LRD 組大鼠鼻癢、噴嚏、清涕3項癥狀評分及總分顯著降低（P＜0.01）；LBA 組大鼠除噴嚏評分高于LRD 組外（P＜0.05），鼻癢、清涕2項評分及總分與LBA 組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 血清中組胺、IL-5、IL-12的水平 與對照組比較，模型組大鼠血清組胺和IL-5水平均顯著升高（P＜0.01），IL-12水平顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，LBA 組及LRD 組大鼠血清組胺、IL-5水平顯著降低（P＜0.01），IL-12水平顯著升高（P＜0.01）；LBA 組與LRD 組比較，大鼠血清組胺和IL-5水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），IL-12水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 ICAM-1mRNA 及蛋白的表達 與對照組相比，模型組大鼠鼻黏膜組織中ICAM-1 mRNA 和蛋白的表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，LBA 組與LRD 組大鼠鼻黏膜中ICAM-1mRNA 和蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；LBA 組與LRD 組比較大鼠鼻黏膜ICAM-1mRNA 和蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1。

表1 癥狀評分結(jié)果（±s，n＝12，分）

表1 癥狀評分結(jié)果（±s，n＝12，分）

a：P＜0.01，與對照組比較；b：P＜0.01，與模型組比較；c：P＜0.05，與LRD組比較。

組別 鼻癢 噴嚏 清涕 總分對照組0.58±0.51 0.36±0.50 0.09±0.30 1.00±0.85模型組 2.83±0.39a 2.55±0.52a 2.64±0.50a 8.08±1.00a LBA組 1.92±0.67b 2.18±0.60bc 1.91±0.54b 6.00±1.04b LRD組 1.42±0.67b 1.55±0.69b 1.64±0.81b 4.50±1.24 b

表2 血清中組胺、IL-5、IL-12水平變化（±s，n＝12）

表2 血清中組胺、IL-5、IL-12水平變化（±s，n＝12）

a：P＜0.01，與對照組比較；b：P＜0.01，與模型組比較；c：P＜0.05，與LRD組比較。

組別組胺（ng／mL） IL-5（ng／mL） IL-12（pg／mL）對照組11.17±1.11 23.33±1.61 60.08±3.83模型組 52.91±1.72a 35.17±1.74a 34.19±2.83a LBA 組 30.75±1.35b 30.08±1.24b 45.36±2.18bc LRD組 26.25±1.60b 27.75±1.21b 37.79±1.23

圖1 鼻黏膜組織ICAM-1mRNA 及蛋白表達

2.4 鼻黏膜組織病理學變化 對照組大鼠鼻黏膜組織無變化。光鏡下模型組大鼠鼻黏膜組織可見柱狀纖毛上皮表現(xiàn)為局限性或彌漫性的增生腫脹。細胞核淡染，細胞體出現(xiàn)腫脹。杯狀細胞明顯增多，黏膜下腺體可見增生樣改變。細胞間質(zhì)可見明顯的充血及水腫現(xiàn)象，并伴有一定數(shù)量的淋巴細胞、漿細胞及嗜酸性粒細胞的浸潤。LBA 組大鼠鼻黏膜組織病理形態(tài)改變能夠見到少量的炎性浸潤，未發(fā)現(xiàn)明顯增生及纖毛倒伏等改變。LRD 組大鼠鼻黏膜組織未見明顯改變，或偶見炎性細胞侵潤。見表3，圖2。

表3 各組大鼠病理評分結(jié)果（±s，n＝12，分）

表3 各組大鼠病理評分結(jié)果（±s，n＝12，分）

a：P＜0.01，與模型組比較。-：此項無數(shù)據(jù)。

組別 病理評分對照組-模型組 3.50±0.53 LBA 組 1.94±0.56a LRD組 1.78±0.72 a

圖2 各組大鼠鼻黏膜組織典型病例切片

3 討 論

AR 是一種以鼻黏膜變應性炎癥為特征的超敏反應性疾病，病變過程由多種細胞因子和多種免疫活性細胞參與［11］。從免疫學角度分析，AR 是體外環(huán)境因素作用于機體產(chǎn)生的異常免疫反應，造成Th細胞免疫反應失衡而引發(fā)的變應性炎性反應［12-13］。Th細胞又可分為Th1細胞和Th2細胞。IL-5是Th2細胞分泌的一種重要細胞因子，對嗜酸性粒細胞的發(fā)育、活化、浸潤有刺激作用，并且能夠延長其存活時間［14］。嗜酸性粒細胞的發(fā)育、浸潤程度與AR 的嚴重程度密切相關。同時IL-5是IgE的正性調(diào)節(jié)因子，促使機體分泌各種炎性物質(zhì)，如組胺、嗜酸性粒細胞趨化因子、花生四烯酸代謝產(chǎn)物，引起各種炎性臨床癥狀。IL-12是Th1細胞分泌的一種重要細胞因子，由單核細胞產(chǎn)生，具有多種免疫調(diào)節(jié)作用，可減少外周血和痰液中的嗜酸性粒細胞的數(shù)量，抑制嗜酸性粒細胞的聚集和浸潤，并可促其凋亡，抑制旁路記憶性T 細胞、嗜酸性粒細胞及肥大細胞脫顆粒［15］。ICAM-1是一種細胞間黏附分子，在變態(tài)反應中主要作為炎癥細胞的黏附和信息交流的可溶性遞質(zhì)、參與介導炎癥細胞穿越血管內(nèi)皮細胞的過程［16-18］。在正常生理情況下鼻黏膜上皮細胞僅表達少量的ICAM-1，而在細胞因子和炎癥介質(zhì)的作用下可引起強烈表達，并且ICAM-1 參與了AR 的發(fā)病機制，其為AR 發(fā)病、治療及預后的監(jiān)測指標［19-20］。

LBA 是一種與人類生活密切相關的益生菌，對人體有營養(yǎng)作用，同時研究還發(fā)現(xiàn)其具有提高免疫力和生物拮抗的作用。隨著研究的不斷開展，已經(jīng)證實了LBA 具有廣泛有效的免疫治療作用。本實驗通過評價AR 大鼠癥狀評分，血清組胺、IL-5、IL-12水平、鼻黏膜組織中ICMA-1mRNA 及蛋白表達，組織病理變化，評價LBA 對AR 的作用。結(jié)果顯示，長期（約6周）給予LBA 后，大鼠3項癥狀評分及總分顯著低于模型組，大鼠鼻黏膜組織切片評分較模型組顯著降低，提示癥狀顯著好轉(zhuǎn)，并且與陽性藥組無顯著性差異；血清組胺、IL-5水平較模型組顯著降低，提示炎癥細胞因子受到抑制，并且與陽性藥組無顯著性差異；血清IL-12水平較模型組顯著升高，并且較陽性藥組顯著提高，提示大鼠免疫能力得到提升；鼻黏膜組織中ICMA-1mRAN 及蛋白表達和模型組相比顯著降低，與陽性藥組相比無顯著性差異。

綜上所述，長期（約6周）給予LBA 可降低血清組胺、IL-5水平及組織中ICMA-1的表達，提高血清IL-12水平對AR 發(fā)揮治療作用。

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