黃用豪，趙煥閣，周松森，林映瑩，譚光宏，黃風(fēng)迎

（海南醫(yī)學(xué)院海南省熱帶病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?71199）

表面抗原43（antigen 43，Ag43）是大腸埃希菌表達(dá)于細(xì)胞表面的重要抗原分子，該分子可以促使大腸埃希菌在特殊條件下形成生物膜，使細(xì)菌可以在極端的條件下生長并獲得對多種抗生素的耐藥性［1-3］，是大腸埃希菌一個(gè)重要的功能分子。和細(xì)菌的菌毛和鞭毛不同，Ag43不需任何輔助分子，轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外膜的所有部件全部存在于該分子的組成結(jié)構(gòu)中。Ag43分子由信號肽、α和β結(jié)構(gòu)域3個(gè)功能部位組成［4-6］，其中信號肽的結(jié)構(gòu)能保證α和β結(jié)構(gòu)域通過細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)膜，β結(jié)構(gòu)域則在細(xì)胞外膜上折疊成為一個(gè)桶狀通道，α結(jié)構(gòu)域穿過這一桶狀通道后表達(dá)于細(xì)菌表面。Ag43的α與β結(jié)構(gòu)域之間通過非共價(jià)鍵結(jié)合，加熱到一定程度后α結(jié)構(gòu)域就離開β結(jié)構(gòu)域并溶解于水溶液中［7］。此外，由于α結(jié)構(gòu)域含有大量的T 和B 淋巴細(xì)胞的抗原表位，因此Ag43還有可能是制備自身抗原分子疫苗，成為打破自身抗原分子免疫耐受的一個(gè)重要的抗原分子。

目前基因敲除是了解基因功能的重要手段，大腸埃希菌Ag43基因敲除后不但可以更進(jìn)一步了解Ag43的功能，也有可能利用這一基因敲除菌作為一個(gè)Ag43嵌合蛋白的表達(dá)宿主細(xì)菌。因此，本研究利用基因工程技術(shù)將Ag43基因敲除并利用PCR 和基因測序技術(shù)對其進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料 含有Ag43基因的大腸埃希菌JM109、細(xì)菌基因敲除試劑盒（TargeTron基因敲除系統(tǒng)，內(nèi)含有pACD4K-C 質(zhì)粒、連接酶、EBS通用引物等）購自Sigma公司。DNA Marker、PCR 試劑盒、凝膠回收純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，內(nèi)切酶NheⅠ和HindⅢ、電泳瓊脂糖、異丙基硫代-B-D-半乳糖苷（IPTG）均購自大連寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 選擇Ag43 基因敲除位點(diǎn)和突變RNA-蛋白復(fù)合體（RNP）的PCR 引物 從PubMed的基因庫中查找到Ag43基因（CP000948.1）序列。登錄Sigma公司提供的分析軟件網(wǎng)站地址（www.sigma-aldrich.com／targetronaccess），將Ag43 基因序列的信息輸入軟件并按照提示進(jìn)行操作，軟件自動報(bào)告基因敲除（插入一個(gè)Group Ⅱintron）的最佳位置，并同時(shí)提供相應(yīng)的3個(gè)PCR 引物（IBS、EBS1d、EBS2）的堿基序列信息。這3個(gè)PCR 引物決定了所敲除基因位點(diǎn)的特異性，由大連寶生物公司合成。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增突變Ⅱ組內(nèi)含子RNP基因序列 將以上合成的3 個(gè)PCR 引物和試劑盒提供的EBS 通用引物混合成Four-primer mix，然后按照說明將試劑盒提供的Water、Intron PCR Template、Jump Start REDTaq Ready mix和Four-primer mix混合成50μL的PCR 反應(yīng)體積。按94 ℃變性15s、55 ℃退火30s、72 ℃延伸30s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)反應(yīng)，最后再72 ℃延伸2min。此后將PCR 產(chǎn)物在1% 瓊脂糖上進(jìn)行電泳分析，凝膠回收純化試劑盒回收相應(yīng)的PCR 產(chǎn)物。

1.2.3 Ⅱ組內(nèi)含子RNP表達(dá)質(zhì)粒pACD4K-C 的構(gòu)建和鑒定 將以上回收的PCR 產(chǎn)物連同試劑盒提供的線性pACD4K-C質(zhì)粒按T4連接酶要求的反應(yīng)條件進(jìn)行連接反應(yīng)，獲得本研究敲除Ag43基因的Ⅱ組內(nèi)含子表達(dá)質(zhì)粒pACD4K-Ag43。此后用上述同樣的酶切方法對獲得的重組質(zhì)粒pACD4K-Ag43進(jìn)行鑒定。

1.2.4 pACD4K-Ag43轉(zhuǎn)化JM109菌株并誘導(dǎo)Ⅱ組內(nèi)含子插入Ag43基因 按照TargeTron 基因敲除系統(tǒng)試劑盒說明書進(jìn)行操作，將以上獲得的pACD4K-Ag43重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化改造宿主細(xì)菌JM109，經(jīng)冰浴和熱休克后加入SOC培養(yǎng)基于37 ℃搖床培養(yǎng)1h，接著取100μL的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物加入到3mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃搖床培養(yǎng)過夜。第3天取40μL的過夜培養(yǎng)物加入到2mL 的LB培養(yǎng)液中，37 ℃搖床培養(yǎng)至OD600值為0.2后，加入IPTG（100mmol／L）誘導(dǎo)質(zhì)粒表達(dá)，最后吸取100μL培養(yǎng)物至含有卡那霉素（25μg／mL）的LB培養(yǎng)基平板上30 ℃培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)獲得的菌株就可能是Ag43基因敲除的菌株。

1.2.5 Ag43基因敲除菌株基因測序鑒定 為了證明以上培養(yǎng)陽性菌株是否Ag43基因敲除菌，隨機(jī)挑選以上培養(yǎng)卡那霉素陽性細(xì)菌并用大腸埃希菌基因組提取試劑盒提取相應(yīng)的細(xì)菌基因組后，采用PCR 方法擴(kuò)增相應(yīng)區(qū)段基因序列進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和基因測序鑒定。具體的PCR 擴(kuò)增策略見圖1所示。圖示中For引物序列為：5′-CCA AAG CTT AAC GGT GA T ACC GG-3′，Rev引物序列為：5′-CCA CTC GAG TCA GAA GGT CAC AT-3′。A 方法采用For和Rev引物，PCR 產(chǎn)物約為4 500bp；B方法用For和EBS通用引物，PCR 產(chǎn)物為1 300～1 400bp；C方法用EBS2和Rev引物，PCR 產(chǎn)物約為3 500bp。最后將相應(yīng)的PCR 產(chǎn)物交由大連寶生物工程有限公司進(jìn)行測序。

圖1 PCR 方法鑒定Ag43基因敲除細(xì)菌的引物位置及相應(yīng)的產(chǎn)物

2 結(jié) 果

2.1 最佳Ⅱ組內(nèi)含子插入位點(diǎn)及相應(yīng)的RNP突變體PCR 引物 Sigma公司提供的分析軟件分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Ag43基因上有多個(gè)位點(diǎn)適合插入Ⅱ組內(nèi)含子，本研究選擇E 值最高的1 812／1 913位點(diǎn)作為本研究的Ⅱ組內(nèi)含子插入位點(diǎn)，同時(shí)選擇這個(gè)位點(diǎn)的IBS、EBS1d和EBS2 3條特異引物供PCR 擴(kuò)增特異RNP突變體，見圖2。

2.2 多重PCR 擴(kuò)增獲得突變體RNP 的PCR 產(chǎn)物 按照Sigma公司的TargeTron基因敲除系統(tǒng)說明書要求，將以上3條PCR 引物連同試劑盒提供的EBS通用引物一起混成引物復(fù)合體，然后按照試劑盒推薦的PCR 反應(yīng)條件進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCR 擴(kuò)增到的產(chǎn)物位于200～400bp之間，和預(yù)期350bp的相對分子質(zhì)量大小相符，說明獲得了Ag43特異RNP突變體的PCR 產(chǎn)物（圖3，泳道1）。

圖2 Ag43基因敲除位點(diǎn)和RNP突變體PCR 引物

2.3 表達(dá)RNP 的重組質(zhì)粒pACD4K-Ag43的構(gòu)建和鑒定 利用T4DNA 連接酶將RNP突變體的PCR 產(chǎn)物插入RNP表達(dá)質(zhì)粒pACD4K-C 中，然后用酶切方法進(jìn)行鑒定。經(jīng)分析，Nhe I在RNP重組質(zhì)粒上有兩個(gè)酶切位點(diǎn)，酶切產(chǎn)物分別為3 646和4 029bp。Hind Ⅲ兩個(gè)位點(diǎn)酶切產(chǎn)物為7 125和550 bp。圖3第2泳道為Nhe Ⅰ酶切結(jié)果，兩個(gè)片段大小和預(yù)測的3 646和4 029bp相一致；圖3泳道3為HindⅢ酶切結(jié)果，切出約7 000和550bp兩個(gè)片段。說明正確構(gòu)建了含Ag43基因特異重組質(zhì)粒，將這一重組質(zhì)粒命名為pACD4K-Ag43。

2.4 Ag43基因敲除陽性菌株JM109（△Ag43）的鑒定 將重組質(zhì)粒pACD4K-Ag43 轉(zhuǎn)化含有Ag43 基因的大腸埃希菌JM109菌株，按照TargeTron基因敲除系統(tǒng)試劑盒所提供誘導(dǎo)和篩選方法，將Ⅱ組內(nèi)含子基因序列插入Ag43 基因堿基1 812／1 813之間，造成Ag43基因功能喪失（基因敲除）。按照圖1顯示的A、B、C 3種鑒定方法對轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)行鑒定。3種PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物分別約為4 500、1 400和3 500bp，大小和預(yù)期相符（圖3，泳道4～6）。另外，將這3 種PCR 產(chǎn)物的DNA 進(jìn)行基因測序，測序結(jié)果和基因庫中的Ag43 基因進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)Ag43基因的1 812／1 813位置插入了一段Ⅱ組內(nèi)含子的DNA 序列。說明JM109菌株中的Ag43 基因被有效敲除，將這一株細(xì)菌命名為JM109（△Ag43）。

圖3 重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定

3 討 論

本研究利用美國Sigma公司的專利細(xì)菌基因敲除試劑盒并按照試劑盒所提供的說明書的方法和步驟將一個(gè)帶有卡那霉素耐藥基因的Ⅱ組內(nèi)含子插入大腸埃希菌JM109Ag43基因堿基1 812／1 913之間，造成Ag43基因功能失活，從而達(dá)到Ag43基因功能敲除的目。它是通過一個(gè)具有程序化限制性內(nèi)切酶活性的RNP 將重組質(zhì)粒pACD4K-C 表達(dá)的Ⅱ組內(nèi)含子插入到Ag43基因中。由于本研究選用了1 812／1 913位點(diǎn)特異的3條PCR 引物（IBS、EBS1d和EBS2）和試劑盒EBS通用引物進(jìn)行多重PCR 反應(yīng)構(gòu)建的pACD4K-Ag43重組質(zhì)粒的特異性，使RNP能夠定點(diǎn)將Ⅱ組內(nèi)含子插入相應(yīng)特異的Ag43基因堿基1812／1913之間。圖3結(jié)果表明，用Nhe I 和Hind Ⅲ二種酶切方法均將重組質(zhì)粒pACD4K-Ag43切出預(yù)想的片段，同時(shí)按照圖1的PCR 擴(kuò)增策略能夠從誘導(dǎo)Ag4基因敲除菌中擴(kuò)增到相應(yīng)的PCR 反應(yīng)產(chǎn)物，這3 種PCR 產(chǎn)物的DNA 序列經(jīng)基因測序分析也發(fā)現(xiàn)Ag43 基因的1 812／1 813位點(diǎn)間確實(shí)插入了一段Ⅱ組內(nèi)含子的DNA 序列，說明本研究獲得了Ag43基因正確敲除的新的菌株JM109（△Ag43）。

Ag43是大腸埃希菌表面表達(dá)的一個(gè)獨(dú)特分子，該分子α結(jié)構(gòu)域受熱至一定溫度后就能從β結(jié)域分離，溶于加熱的水溶液中，離心將菌沉淀后液體上清中就含有單一的α結(jié)構(gòu)域分子。細(xì)菌鞭毛和菌毛是典型的細(xì)菌表面抗原分子，有人已經(jīng)設(shè)想利用細(xì)菌鞭毛或菌毛作為細(xì)菌表面表達(dá)嵌合抗原分子的載體［8］。但是，利用細(xì)菌鞭毛或菌毛表達(dá)嵌合抗原分子存在較明顯的缺點(diǎn)，主要表現(xiàn)為表達(dá)的分子受到表達(dá)分子大小的制約，插入外源分子也會影響載體蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，同時(shí)還降低載體的拷貝數(shù)［8］。另外，大多數(shù)細(xì)胞表面表達(dá)的抗原分子還受限于宿主細(xì)菌的背景，將這類細(xì)胞表面表達(dá)分子作為外源抗原分子的展示分子不具有普適性。顯然，作為外源抗原分子的展示載體的細(xì)菌表面抗原分子必須能夠適應(yīng)較大的外源插入分子，同時(shí)還應(yīng)具有較高的拷貝數(shù)及常見表達(dá)宿主的普適性。研究結(jié)果表明，一個(gè)大腸埃希菌細(xì)胞表面就有多達(dá)50 000個(gè)Ag43抗原分子，利用基因工程將Ag43構(gòu)建成一個(gè)重組原核表達(dá)載體后，發(fā)現(xiàn)這一重組原核表達(dá)載體也能夠在肺炎克雷伯桿菌和綠膿桿菌中大量表達(dá)，表達(dá)外還能夠改變宿主細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)［7］。此外，將Ag43作為外原抗原分子的表達(dá)載體比菌毛載體具有更好的表達(dá)能力，菌毛載體只能表達(dá)20～30個(gè)氨基酸的外源抗原分子，但Ag43載體表達(dá)的外源抗原分子則可高達(dá)500個(gè)氨基酸［7］。研究結(jié)果還表明，Ag43的免疫原性很強(qiáng)，同時(shí)還具有很多的T和B淋巴細(xì)胞抗原表位，可以促使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生高強(qiáng)度的免疫應(yīng)答［9］。本研究獲得的Ag43基因敲除菌JM109（△Ag43）來自常用基因程表達(dá)宿主菌JM109，如果同時(shí)和一個(gè)可以表達(dá)Ag43嵌合分子的表達(dá)載體結(jié)合，二者就可以構(gòu)成一個(gè)制備外源抗原分子的嵌合蛋白疫苗的表達(dá)系統(tǒng)，在制備疫苗和研究Ag43基因功能等方面都具有良好的應(yīng)用前景。

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