李　濤，王雪巖，姜秀良，梁立升，李愛芝，馬宏仲，馬加海※

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院麻醉科，山東 煙臺(tái)264000； 2.煙臺(tái)市疾病預(yù)防控制中心，山東 煙臺(tái)264000)

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缺血后處理對(duì)大鼠腎缺血/再灌注損傷及p38MAPK活性的影響

李濤1△，王雪巖2，姜秀良1，梁立升1，李愛芝1，馬宏仲1，馬加海1※

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院麻醉科，山東 煙臺(tái)264000； 2.煙臺(tái)市疾病預(yù)防控制中心，山東 煙臺(tái)264000)

摘要：目的研究缺血后處理(IPO)對(duì)大鼠腎缺血/再灌注損傷(IRI)及p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)活性的影響。方法將24只SD大鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為3組,各8只。對(duì)照(S)組：僅結(jié)扎右側(cè)腎蒂，左腎蒂游離；缺血/再灌注(IR)組：結(jié)扎右側(cè)腎蒂，夾閉左側(cè)腎蒂60 min后，開放灌注24 h；IPO組：腎臟缺血60 min后，進(jìn)行10 s灌注、10 s阻斷，共6個(gè)循環(huán)的IPO，然后開放灌注24 h，余同IR組。檢測(cè)血尿素氮(BUN)、肌酐，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)腎組織腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1(IL-1)水平，Western blot法檢測(cè)腎組織磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)，觀察腎組織的病理學(xué)變化。結(jié)果與S組比較，IR組和IPO組血BUN、肌酐，腎TNF-α、IL-1、p38MAPK蛋白表達(dá)量及組織病理評(píng)分顯著增加(P<0.05)；IPO組各指標(biāo)較IR組顯著下降(P<0.05)。結(jié)論IPO能減輕腎IRI，其機(jī)制與抑制p38MAPK活化，進(jìn)而抑制炎性因子釋放有關(guān)。

關(guān)鍵詞：缺血/再灌注損傷；腎臟；缺血后處理；p38絲裂原活化蛋白激酶

腎臟缺血/再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)是引起急性腎衰竭的重要原因之一，缺血后處理(ischemic postconditioning，IPO)是一種新的減輕器官IRI的方法，可操作性強(qiáng)，對(duì)心、腦等器官IRI有確切的保護(hù)作用[1-2]，但對(duì)腎臟IRI的研究結(jié)果不一，機(jī)制尚不明確。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)是MAPK的一個(gè)亞類。研究發(fā)現(xiàn)，腎臟IRI后p38MAPK活化，進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素1(interleukin 1,IL-1)等炎性細(xì)胞因子釋放增加，導(dǎo)致腎臟損傷[3]。本研究擬探討IPO對(duì)大鼠腎臟IRI及p38MAPK活性的影響。

1材料與方法

1.1材料選擇清潔級(jí)健康8~ 10周SD雄性大鼠(購(gòu)自煙臺(tái)綠葉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)24只，體質(zhì)量210～240 g，動(dòng)物許可證號(hào)SYXY(魯)20030020。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，自由飲水。依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：對(duì)照(S)組、缺血/再灌注(IR)組、IPO組，每組8只。

1.2方法以戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，將所有大鼠麻醉后固定于操作臺(tái)上。S組：尾靜脈輸注生理鹽水，腹部正中切口進(jìn)入腹腔，小心分離出雙側(cè)腎蒂，僅結(jié)扎右側(cè)腎蒂，左腎蒂游離。IR組：結(jié)扎右側(cè)腎蒂，用無損傷微動(dòng)脈夾夾閉左側(cè)腎蒂60 min后，松開動(dòng)脈夾后充分開放灌注24 h，腎臟由暗紅色恢復(fù)鮮紅色即可確認(rèn)血流恢復(fù)。IPO組：腎臟缺血60 min后，進(jìn)行開放灌注10 s、阻斷10 s 共6個(gè)循環(huán)的IPO，然后充分開放灌注24 h。

1.3標(biāo)本留取再灌注24 h后，從下腔靜脈抽取靜脈血2～4 mL置于抗凝管內(nèi)，靜置4 h后分離血清，-70 ℃保存待用。分離左側(cè)腎臟，濾紙吸干表面水分，將腎臟縱剖后取腎皮質(zhì)100～200 mg，精確稱重后用剪刀剪碎移入勻漿管內(nèi)按溶質(zhì)質(zhì)量/溶液體積=1/9的比例加入4 ℃生理鹽水，在冰浴中進(jìn)行勻漿，制備成100 mg/L的腎組織勻漿液，以4 ℃低溫離心機(jī)離心后取上清液于液氮速凍后置于-70 ℃冰箱中保存待用。同時(shí)摘取部分左腎組織置于4%多聚甲醛固定。

1.4檢測(cè)指標(biāo)采用全自動(dòng)生化分析儀(Siemens-ADVIA2400)常規(guī)生化分析法測(cè)定血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和肌酐，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)腎組織勻漿(上清)TNF-α、IL-1水平。Western blot法檢測(cè)腎組織磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)。通過AlphaEase FC軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)量，以β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參照，膠片掃描并照相，測(cè)定各條帶A值。以目的蛋白和β肌動(dòng)蛋白條帶A值之比反映p38MAPK蛋白表達(dá)程度。左腎組織常規(guī)石蠟包埋，常規(guī)制片蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡觀察病理變化，按照J(rèn)ablonski等[4]描述的病理分級(jí)法將組織損傷程度分為0～4級(jí)。0級(jí):正常；1級(jí):單個(gè)細(xì)胞的壞死伴核分裂；2級(jí):相鄰近曲小管所有細(xì)胞壞死，但周圍小管存活；3級(jí):限定于近曲小管遠(yuǎn)端1/3細(xì)胞的壞死并擴(kuò)展到皮質(zhì)和髓質(zhì)交界處；4級(jí):近曲小管整段壞死。

2結(jié)果

2.1各組大鼠血清BUN、肌酐和腎組織TNF-α、IL-1水平的變化與S組比較，IR組和IPO組血BUN和肌酐水平顯著增加(P<0.05)；與IR組比較，IPO組血BUN和肌酐水平顯著下降(P<0.05)。 與S組比較，IR組和IPO組腎組織TNF-α、IL-1水平顯著升高(P<0.05)；與IR組比較，IPO組TNF-α、IL-1水平顯著下降(P<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠血清BUN、肌酐和腎組織

BUN：血尿素氮； TNF-α：腫瘤壞死因子α；IL-1：白細(xì)胞介素1；S組:對(duì)照組；IR組:缺血/再灌注組；IPO組：缺血后處理組；a與S組比較，P<0.05；b與IR組比較，P<0.05

2.2腎組織磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)及病理分級(jí)IR組和IPO組p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于S組(P<0.05)，IPO組p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于IR組(P<0.05)。與S組比較，IR組和IPO組腎組織病理分級(jí)升高(P<0.05)；與IR組比較，IPO組病理分級(jí)下降(P<0.05)。見表2。

表2　各組大鼠腎組織磷酸化p38MAPK

p38MAPK：p38絲裂原活化蛋白激酶；S組:對(duì)照組；IR組:缺血/再灌注組；IPO組：缺血后處理組；a與S組比較，P<0.05；b與IR組比較，P<0.05

2.3腎組織病理學(xué)改變光鏡下S組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常(圖1A)；IR組見明顯腎組織病理學(xué)損傷，主要表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞脫落、基膜斷裂和腎小管阻塞，間質(zhì)有水腫、充血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B)；IPO組腎臟組織學(xué)改變輕微，僅見少數(shù)腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、部分管腔擴(kuò)張、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1C)。

圖1　各組SD大鼠腎臟缺血/再灌注后處理的光鏡下形態(tài)學(xué)改變(HE染色,×100)　A：對(duì)照組；B：缺血/再灌注組；C：缺血后處理組

3討論

本研究采用先結(jié)扎右側(cè)腎蒂，夾閉左側(cè)腎蒂60 min再灌注24 h制備腎臟缺血再灌注損傷模型，避免對(duì)側(cè)腎的代償作用。BUN、肌酐能密切反映腎細(xì)胞的受損情況，本研究中IR組肌酐、BUN水平明顯升高，腎組織損傷嚴(yán)重，說明成功建立腎IRI模型。

急性缺血是急性腎衰竭的最常見原因，再灌注加重腎損傷，如何有效地減輕腎臟IRI是目前研究的熱點(diǎn)。IPO能否發(fā)揮保護(hù)作用，最關(guān)鍵的影響因素有兩個(gè)：循環(huán)次數(shù)和短暫復(fù)灌/缺血的持續(xù)時(shí)間。有學(xué)者研究了不同IPO方案抗大鼠腎IRI的作用，認(rèn)為6個(gè)循環(huán)10 s灌注/10 s阻斷的方案最佳[5]。因此本研究采用了此方案。結(jié)果表明，IPO組血清BUN和肌酐水平較IR組顯著降低，組織損傷亦減輕，說明IPO保護(hù)了腎臟的組織結(jié)構(gòu)與功能。腎臟IRI機(jī)制十分復(fù)雜，近年來白細(xì)胞聚集及急性期反應(yīng)的一些細(xì)胞炎性因子的作用日益受到重視，已證實(shí)腎缺血時(shí)，腎組織局部可產(chǎn)生多種炎性介質(zhì)，其中包括TNF-α、IL-1、IL-6等[6]。本研究結(jié)果顯示，IRI后腎組織TNF-α、IL-1水平也明顯增加，提示IRI后炎性因子釋放可能是導(dǎo)致腎臟組織結(jié)構(gòu)與功能損傷的重要原因。

研究認(rèn)為，IPO的作用機(jī)制主要包括：氧自由基的生成減少，腺苷、一氧化氮等內(nèi)源性活性物質(zhì)的釋放及ATP敏感性鉀通道等[7-8]。p38MAPK信號(hào)通路是近年來發(fā)現(xiàn)的廣泛存在于各種動(dòng)物細(xì)胞中的一條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，p38MAPK產(chǎn)生于胞質(zhì)，可被多種胞外刺激激活，激活后移位入核而發(fā)揮作用[9]。有研究證明，p38MAPK信號(hào)通路參與IRI等多種因素所致炎癥反應(yīng)調(diào)控，缺血/再灌注期間，p38MAPK活化，單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等被激活后釋放TNF-α、IL-1、IL-6等炎性細(xì)胞因子，后者通過多種途徑參與細(xì)胞的損傷，而阻斷p38 MAPK信號(hào)通路能減輕腎臟IRI[10]。本研究結(jié)果顯示，腎IRI后磷酸化p38MAPK蛋白的表達(dá)水平升高，而IPO組表達(dá)水平降低，提示IPO能抑制大鼠腎臟IRI后p38MAPK的活化，減少TNF-α、IL-1等炎性因子的釋放，降低炎癥反應(yīng)程度，從而保護(hù)腎臟的組織結(jié)構(gòu)與功能。

綜上所述，IPO能減輕腎臟IRI，其機(jī)制與抑制腎臟IRI后p38MAPK活化，從而抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

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Effects of Ischemic Postconditioning on Ischemia Reperfusion Injury and Expression of p38MAPK Protein in Rat KidneyLITao1,WANGXue-yan2,JIANGXiu-liang1,LIANGLi-sheng1,LIAi-zhi1,MAHong-zhong1,MAJia-hai1.(1.DepartmentofAnesthesiology,YantaiYuhuangdingHospital,QingdaoUniversityMedicalCollege,Yantai264000,China； 2.YantaiCenterforDiseaseControlandPrevention，Yantai264000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of ischemic postconditioning on ischemia reperfusion injury(IRI)and expression of p38 mitogen-activated protein kinase(p38MAPK) protein in rat kidney.MethodsA total of 24 SD rats were allocated randomly into 3 groups(n=8 per group).Sham (S) group:rats received continuous intravenous infusion of normal saline and clamping the right renal pedicles.IR group(IR):renal IRI was induced by clamping both renal pedicles 60 minutes followed by 24 h reperfusion.Ischemic postconditioning(IPO) group:ischemic postconditioning was given six cycles of 10 s reperfusion/10 s occlusion followed by 24 h reperfusion.Serum blood urea nitrogen(BUN), creatinine(Cr) was detected.ELISA was used to detect the tumor necrosis factor α (TNF-α),interleukin 1 (IL-1) in kidney.Western blot was applied to detect the expression of p38MAPK protein.Renal histopathology lesions were also examined.ResultsCompared with group S,the serum BUN and Cr,renal TNF-α and IL-1,expression of p38MAPK protein increased significantly in group IR and group IPO(P<0.05).Compared with group IR,all indexes in group IPO decreased significantly(P<0.05).ConclusionIPO can attenuate renal IRI in rats.The mechanism is related to inhibition of p38MAPK expression and inflammatory factor release.

Key words:Ischemia reperfusion injury; Kidney; Ischemic postconditioning; p38 mitogen-activated protein kinase

收稿日期:2013-07-01修回日期:2014-10-23編輯：伊姍

基金項(xiàng)目：煙臺(tái)市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2009155-12)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.11.048

中圖分類號(hào)：R692.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)11-2049-03