肖會(huì)敏，劉 洋，何 悅，趙 榮，王四旺

(1．中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物研究所，陜西 西安 710032； 2．陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712000；3．陜西海天制藥有限公司，陜西 咸陽(yáng) 712000)

四季抗病毒合劑制備中3個(gè)有機(jī)酸轉(zhuǎn)移率的研究

肖會(huì)敏1，劉 洋2，何 悅1，趙 榮3，王四旺1

(1．中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物研究所，陜西 西安 710032； 2．陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712000；3．陜西海天制藥有限公司，陜西 咸陽(yáng) 712000)

目的建立測(cè)定菊花與四季抗病毒合劑中綠原酸、1，3-二咖啡?？鼘幩帷?，5-二咖啡?？鼘幩?，以及魚腥草中綠原酸含量的方法，并探討其在菊花與魚腥草藥材至四季抗病毒合劑制劑間的轉(zhuǎn)移率。方法采用超快速液相色譜（UFLC）法；選取3批菊花與魚腥草藥材，每批對(duì)應(yīng)5批制劑。結(jié)果3批菊花藥材中，綠原酸含量分別為2．110 21，2．131 03，2．191 12 mg／g，1，3-二咖啡酰奎寧酸含量分別為1．414 22，1．203 72，1．312 66 mg／g，3，5-二咖啡?？鼘幩岷糠謩e為7．210 98，7．310 54，7．284 53 mg／g。3批魚腥草藥材中，綠原酸的含量分別為0．721 11，0．754 31，0．760 53 mg／g。每批菊花與魚腥草藥材對(duì)應(yīng)5批制劑中，綠原酸的平均含量分別為0．249 62，0．254 07，0．261 73 g／L，RSD分別為0．70%，1．47%，1．60%；1，3-二咖啡酰奎寧酸的平均含量分別為0．120 61，0．105 20，0．112 46 g／L，RSD分別為 0．39%，1．46%，0．20%；3，5-二咖啡?？鼘幩岬牡钠骄糠謩e為 0．168 49，0．169 41，0．173 32 g／L，RSD分別為0．78%，0．66%，2．16%；15批制劑中綠原酸、1，3-二咖啡酰奎寧酸、3，5-二咖啡酰奎寧酸在藥材至四季抗病毒合劑制劑間的轉(zhuǎn)移率分別為73．58%，71．76%，19．54%，RSD分別為1．26%，1．38%，1．73%。結(jié)論該含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為藥材與四季抗病毒合劑中綠原酸、1，3-二咖啡?？鼘幩?、3，5-二咖啡?？鼘幩岬亩糠椒?。綠原酸、1，3-二咖啡?？鼘幩岬霓D(zhuǎn)移率高，表明制劑制備工藝有利于該有效成分的溶出，為制劑療效提供了理論依據(jù)。

四季抗病毒合劑；超快速液相色譜；綠原酸；1，3-二咖啡?？鼘幩幔?，5-二咖啡?？鼘幩?/p>

四季抗病毒合劑系國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準(zhǔn)生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)制劑，由菊花、連翹、魚腥草等11味中藥組方，主要用于上呼吸道感染、病毒性感冒、流行性感冒等病毒性感染疾病，對(duì)小兒呼吸道病毒性感染效果顯著[1]。該制劑主要含連翹酯苷、連翹苷、甘草苷、甘草酸等成分[1]。菊花是該制劑的君藥之一，含萜類、有機(jī)酸類化合物等，有機(jī)酸包括綠原酸、1，3-二咖啡?？鼘幩?、3，5-二咖啡?？鼘幩岬萚2]。綠原酸是一種有效的抗病毒中藥單體，對(duì)大部分病毒有很好的抑制作用[3]；二咖啡?？鼘幩峋哂锌共《?、抗炎、調(diào)血脂等作用[4]。目前，尚未見(jiàn)對(duì)該制劑中綠原酸、1，3-二咖啡?？鼘幩帷?，5-二咖啡酰奎寧酸等3個(gè)成分轉(zhuǎn)移率的研究報(bào)道，故筆者采用超快速液相色譜（UFLC）法研究此3個(gè)成分在四季抗病毒合劑制備中的轉(zhuǎn)移率，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Prominence UFLC高效液相色譜儀（日本島津公司），ME235S型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；KQ-300DE型數(shù)控超聲波發(fā)生器（昆山超聲儀器有限公司）。乙腈、甲醇（美國(guó)Honeywell公司）均為色譜純；超純水，自制；綠原酸（批號(hào)為 110753-201415）、1，3-二咖啡酰奎寧酸（批號(hào)為 111717-201402）、3，5-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)為111782-201405）對(duì)照品，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；菊花、魚腥草藥材（批號(hào)分別為20150508，20150512，20150515）與四季抗病毒合劑（批號(hào)分別為20150520，20150521，20150522，20150523，20150524，20150527，20150528，20150529，20150530，20150531，20150605，20150606，20150607，20150608，20150609），由陜西海天制藥有限公司生產(chǎn)并提供。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0．3%磷酸水溶液溶液(B)，梯度洗脫，0～11 min時(shí)B 95%→82%，11～30 min時(shí)B 82%→80%，30～45 min時(shí)B 80%；流速：0．8 mL／min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：348 nm；進(jìn)樣量:10 μL[1]。

2．2 溶液制備

精密稱取綠原酸、1，3-二咖啡?？鼘幩帷?，5-二咖啡?？鼘幩?．68，7．04，7．68 mg，置10 mL容量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液，作為貯備液[5]。取四季抗病毒合劑1瓶，搖勻，精密量取2．5 mL，置5 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過(guò)（濾膜0．22 μm），取續(xù)濾液作為四季抗病毒合劑供試品溶液[1]。菊花在投料前隨機(jī)取樣，干燥粉碎，稱取粉末（過(guò)一號(hào)篩）約0．25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率為45 kHz）40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得菊花藥材供試品溶液[5]。魚腥草在投料前隨機(jī)取樣，干燥粉碎，精密稱取經(jīng)干燥粉碎過(guò)40目的魚腥草樣品1．0 g，置于50 mL錐形瓶中，加60%的乙醇50 mL，密塞，浸漬約2 h，超聲處理 60 min，搖勻，過(guò)濾，用 60%的乙醇定容至 50 mL。再經(jīng)0．45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得魚腥草藥材供試品溶液[6]。依據(jù)處方，制備缺菊花與魚腥草藥材的制劑，再按四季抗病毒合劑供試品溶液制備方法制備菊花與魚腥草陰性對(duì)照品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn)：取2．2項(xiàng)下各溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果陰性對(duì)照品溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

圖1 超快速液相色譜圖

表1 對(duì)照品的線性方程及其濃度范圍

線性關(guān)系考察：分別精密量取 2．2項(xiàng)下貯備液 0．125，0．250，0．500，1．250，2．500 mL，分別置5 mL容量瓶中并加70%甲醇稀釋至刻度，用0．22 μm微孔濾膜濾過(guò)，進(jìn)樣。以各對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（μg／mL）為橫坐標(biāo)(X)、峰面積值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見(jiàn)表1。

精密度試驗(yàn):精密吸取對(duì)照品溶液（精密量取0．500 mL貯備液加70%甲醇至5 mL），重復(fù)進(jìn)樣5次。結(jié)果綠原酸、1，3-二咖啡?？鼘幩?、3，5-二咖啡酰奎寧酸的 RSD分別為 1．02%，1．00%，0．88%(n=5)，表明該方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品（批號(hào)為20150520）溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h時(shí)進(jìn)樣。結(jié)果綠原酸、1，3-二咖啡酰奎寧酸、3，5-二咖啡?？鼘幩岱迕娣e的 RSD分別為 0．88%，1．02%，1．16%(n=6)，表明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取5份樣品（批號(hào)為20150520），分別依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果綠原酸、1，3-二咖啡?？鼘幩?、3，5-二咖啡?？鼘幩崞骄糠謩e為0．252 55，0．120 66，0．169 29 g／mL，結(jié)果的 RSD分別為1．07%，0．92%，0．96%(n=5)，表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量的樣品（批號(hào)為20150520，含綠原酸、1，3-二咖啡?？鼘幩帷?，5-二咖啡酰奎寧酸分別為0．252 55，0．120 66，0．169 29 g／L）2．50 mL，分別添加混合對(duì)照品溶液（精密稱取綠原酸、1，3-二咖啡?？鼘幩?、3，5-二咖啡?？鼘幩徇m量，制成每1 mL溶液中含量分別為0．630 00，0．300 00，0．420 00 mg）0．80，1．00，1．20 mL，依法制備供試品溶液，各制備6份樣品，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2．4 樣品含量測(cè)定

精密量取15批樣品2．50 mL，分別按2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液；按擬訂色譜條件測(cè)定各組分含量。結(jié)果見(jiàn)表3及表4。每批菊花與魚腥草藥材對(duì)應(yīng)5批制劑中綠原酸的平均含量分別為 0．249 62，0．254 07，0．261 73 g／L，結(jié)果的 RSD分別為0．70%，1．47%，1．60%；1，3-二咖啡?？鼘幩岬钠骄糠謩e為 0．120 61，0．105 20，0．112 46 g／L，RSD分別為 0．39% ，1．46%，0．20%；3，5-二咖啡?？鼘幩岬牡钠骄糠謩e為0．168 49，0．169 41，0．173 32 g／L，結(jié)果的 RSD分別為 0．78%，0．66%，2．16%。

表3 藥材魚腥草中綠原酸與菊花中3種成分含量的測(cè)定結(jié)果（mg／g，n=3）

表4 藥材與四季抗病毒合劑中3種成分的轉(zhuǎn)移率（n=3）

3 討論

檢測(cè)方法選擇：筆者在以前研究的基礎(chǔ)上調(diào)整檢測(cè)方法中的檢測(cè)時(shí)間與檢測(cè)溫度，為節(jié)省流動(dòng)相與分析時(shí)間，把分析檢測(cè)時(shí)間定為45 min，柱溫調(diào)為35℃。

檢測(cè)波長(zhǎng)選擇：測(cè)定3個(gè)化合物含量檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇，根據(jù)二極管陣列對(duì)綠原酸、1，3-二咖啡?？鼘幩帷?，5-二咖啡?？鼘幩釖呙瑁Y(jié)果其吸收在348 nm波長(zhǎng)處各峰分離度大于1．5，無(wú)其他峰干擾，故選擇348 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

溶液制備方法選擇：各對(duì)照品溶液的制備依據(jù)文獻(xiàn)[5]制備，供試品溶液的制備參照文獻(xiàn)[1]制備。陰性對(duì)照品溶液的制備，依據(jù)菊花藥材中的主要成分[1]，由于魚腥草的主要成分中也含有綠原酸[7]，故制備陰性對(duì)照品溶液時(shí)應(yīng)將菊花與魚腥草同時(shí)去除。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

轉(zhuǎn)移率比較:通過(guò)3批藥材及對(duì)應(yīng)15批制劑中2種成分含量的計(jì)算比較，發(fā)現(xiàn)綠原酸、1，3-二咖啡?？鼘幩徂D(zhuǎn)移率較高，分別為73．58%和71．76%，說(shuō)明該制劑的制備工藝有助于溶出，但另一成分轉(zhuǎn)移率較低，至于其原因，將進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究中建立的方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，為提升該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和進(jìn)一步檢測(cè)其他功效成分等奠定了基礎(chǔ)。

[1]肖會(huì)敏，何 悅，陳 飛，等．四季抗病毒合劑的超快速液相色譜法指紋圖譜研究及4個(gè)成分含量測(cè)定[J]．中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2015，35(3):230-233．

[2]瞿 璐，王 濤，董勇 ，等．菊花化學(xué)成分與藥理作用的研究進(jìn)展[J]．藥物評(píng)價(jià)研究，2015，38(1):98-104．

[3]李 捷．綠原酸抗病毒研究進(jìn)展[J]．專論與綜述，2013，8(13):6-7．

[4]李祖晟，朱志安．二咖啡?？鼘幩崴幚韺?shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J]．醫(yī)學(xué)綜述，2004，10(4):249-251．

[5]國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典(二部)[M]．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:292．

[6]杜向群，陳敏燕，許 穎．魚腥草成分、藥理的研究進(jìn)展[J]．江西中醫(yī)藥，2012，43(2):66-68．

[7]王 蓮，袁 藝．不同產(chǎn)地魚腥草中綠原酸、棚皮素含量測(cè)定[J]．藥物分析雜志，2012，43(2):1 081-1 083．

Transfer Rates of 3 Kinds of Organic Acids in the Preparation of Sijikangbingdu Heji

Xiao Huimin1,Liu Yang2,He Yue1,Zhao Rong3,Wang Siwang1
(1．Institute of Materia Medica,School of Pharmacy,The Fourth Military Medical University,Xi′an,Shaanxi,China 710032; 2．Shaanxi University of Chinese Medicine,Xianyang,Shaanxi,China 712000; 3．Shaanxi Haitian Pharmaceutical Limited Company,Xianyang,Shaanxi,China 712000)

Objective To establish a UFLC method for determining the contents of chlorogenic acid,1,3-O-dicaffeoylquinic acid and 3,5-O-dicaffeoylquinic acid in Chrysanthemi flos and Sijikangbingdu Heji,and of chlorogenic acid in Houttuyniae herba,and to clarify their transfer rates in the preparation．M ethods UFLC analysis was adopted,then 3 batches of Chrysanthemi flos and Houttuyniae herba were selected,every batch of which included five batches of Sijikangbingdu Heji．Results The contents of chlorogenic acid in the 3 batches of Chrysanthemi flos were 2．110 21,2．131 03,2．191 12 mg／g,1,3-O-dicaffeoylquinic acid 1．414 22,1．203 72,1．312 66 mg／g, and 3,5-O-dicaffeoylquinic acid 7．210 98,7．310 54,7．284 53 mg／g,respectively．And the contents of chlorogenic acid in three batches of Houttuyniae herba were 0．721 11,0．754 31,0．760 53 mg／g,respectively．And the average content of chlorogenic acid in every 5 batches of Sijikangbingdu Heji were 0．249 62,0．254 07,0．261 73 g／L,and RSDs were 0．70%,1．47%,1．60% respectively; 1,3-O-dicaffeoylquinic acid 0．120 61,0．105 20,0．112 46 g／L,and RSDs 0．39%,1．46%,0．20% respectively;3,5-O-dicaffeoylquinic acid 0．168 49,0．169 41,0．173 32 g／L,RSD 0．78%,0．66%,2．16% respectively．And the transfer rate of 15 batches of Sijikangbingdu Heji in the preparation were respectively 73．58%,71．76%,19．54% and RSDs were 1．26%,1．38%,1．73%,respectively．Conclusion The method for determination of their content is of simple,stable and reliable,accurate and other advantages,so it can be used as a quantitative method of chlorogenic acid,1,3-O-dicaffeoylquinic acid and 3,5-O-dicaffeoylquinic acid for Sijikangbingdu Heji and medicinal materials．And the transfer rate of chlorogenic acid and 1,3-O-dicaffeoylquinic acid is high in the preparation,which is conducive to the two active ingredients in the solution,so,which provides a theoretical basis for the preparation of curative effect．

Sijikangbingdu Heji;UFLC;chlorogenic acid;1,3-O-dicaffeoylquinic acid;3,5-O-dicaffeoylquinic acid

R284；R286；TQ461

A

1006-4931(2015)21-0034-03

肖會(huì)敏，男，在讀博士研究生，主管藥師，研究方向?yàn)橹兴幬镄ЩA(chǔ)，（電話）029-84772165(電子信箱)xhm_0908＠163．com；王四旺，男，碩士研究生，博士研究生導(dǎo)師，教授，研究方向?yàn)橹兴帉W(xué)，本文通訊作者，（電話）029-84772165(電子信箱) wangsiw＠fmmu．edu．cn。

2015-06-17)

陜西省“13115”科技創(chuàng)新工程工程技術(shù)研究中心組建計(jì)劃項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：2013ZDGC-01。