王雷 王陽 吳小榮 沙建軍 陳勇輝 薛蔚 薄雋杰 劉東明 黃翼然

·實驗研究·

DDR2在腎透明細胞癌中的表達及意義

王雷 王陽 吳小榮 沙建軍 陳勇輝 薛蔚 薄雋杰 劉東明 黃翼然

目的探討盤狀結(jié)構(gòu)域受體2(DDR2)在腎透明細胞癌與正常腎組織中的表達及其臨床意義。方法分別采用免疫組織化學染色和Real-time PCR檢測DDR2在腎透明細胞癌及相應癌旁正常腎組織中的表達，進一步分析其表達與腎透明細胞癌相關(guān)臨床病理特征間的關(guān)系。結(jié)果腎透明細胞癌組織中DDR2蛋白及mRNA與癌旁組織比較均呈現(xiàn)異常低表達(P<0.05),且腎透明細胞癌組織中DDR2的表達與腎癌臨床分期及組織學分級呈負相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論DDR2在腎透明細胞癌組織中的表達較正常腎組織低，且其表達量與腎癌的臨床分期和病理分級呈負相關(guān)，提示DDR2可能在腎透明細胞癌中扮演抑癌基因的角色,但具體機制還需進一步深入研究。

【關(guān)鍵詞】腎透明細胞癌； DDR2； 抑癌基因

腎癌又稱腎細胞癌(renal cell carcinoma,RCC), 主要起源于腎小管上皮細胞，是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，占成人所有惡性腫瘤的2%～3%[1]，最主要的病理類型是腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)，約占腎癌的70%～85%[2]。目前腎癌的治療以手術(shù)為主，但仍有20%～40%的患者術(shù)后出現(xiàn)腫瘤復發(fā)。盡管目前靶向藥物治療可以延長晚期腎癌患者的生存時間，但因腎癌對放療、化療等其他治療方式效果不佳，整體預后較差。因此研究腎癌的病因?qū)W對腎癌的早期診斷、治療和預后至關(guān)重要。

盤狀結(jié)構(gòu)域受體2(discoidin domain receptor 2，DDR2)是一種受體型蛋白酪氨酸激酶，能特異性地和一系列膠原配體(Ⅰ～Ⅲ、Ⅹ型膠原)相結(jié)合并被膠原激活，進而發(fā)揮一系列的生物學作用[3]。本研究應用免疫組織化學染色法和Real-time PCR研究DDR2在ccRCC及正常腎組織中的表達情況,以期對DDR2在ccRCC發(fā)生、發(fā)展中的作用及預后意義的研究提供幫助。

材料與方法

一、一般資料

取2013年4月至2015年3月泌尿外科行手術(shù)治療的87例ccRCC患者的癌組織及其中53例患者的正常腎臟組織標本作為研究對象，均經(jīng)病理證實。87例ccRCC患者中，男24例，女63例，年齡26～78歲。所有患者術(shù)前均未接受任何治療，且排除轉(zhuǎn)移性RCC。收集患者性別、年齡、腫瘤大小、病理分級、分期(根據(jù)AJCC 2009標準)情況等資料。

二、主要試劑

一抗為多克隆兔抗人DDR2抗體(H-108：sc-8989, 美國Santa Cruz Biotechnology), 二抗為辣根過氧化物酶標記的抗兔二抗(美國DAKO公司)。RNA提取試劑Trizol購自 Invitrogen 公司；RT試劑盒購自Fermentas 公司；Premix Taq?Version 2.0 PCR擴增試劑盒購自TAKARA公司；引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

三、Real-time PCR

四、免疫組織化學染色

將收集到的腎癌組織蠟塊標本制成4 μm切片，經(jīng)脫蠟、水化后置入檸檬酸緩沖液中高溫高壓進行抗原修復。過氧化物酶阻斷劑覆蓋樣品5～10 min，封閉內(nèi)源性過氧化物酶。PBS液漂洗3次×5 min；綿羊血清阻斷劑覆蓋樣品15 min后棄去，以卵白素阻斷試劑孵育樣品，持續(xù)15 min后PBS緩沖液沖洗樣品3次×5 min，加入生物素阻斷試劑孵化樣品，持續(xù)15 min后PBS緩沖液沖洗樣品3次×5 min。DDR2抗體(1∶500)濕盒中孵育樣品，4 °C冰箱過夜，次日生物素標記的抗兔二抗(1∶5 000)37 ℃孵育20 min、SABC 37 ℃孵育 20 min ，最后滴加DAB顯色5 min，蘇木素復染后脫水封片。PBS代替一抗作陰性對照。

DDR2陽性結(jié)果判斷標準：細胞質(zhì)及包膜內(nèi)出現(xiàn)淡黃色至棕黃色染色為陽性細胞，隨機選擇5個高倍鏡視野(×200)進行判斷。結(jié)果判定：染色強度陰性為0分，淡黃色染色計1分，中度黃色染色計2分，棕黃色強染色計3分；同時對陽性細胞百分比進行評分(0～100%)：無陽性細胞計0分，1%～30%計1分，31%～60%計2分，>60%計3分。上述兩項相乘，總分0～3為低表達，4～9分為高表達。

五、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、免疫組化染色法評估DDR2蛋白在ccRCC及癌旁正常腎組織中的表達情況

癌旁正常腎臟組織中均可見 DDR2蛋白呈強陽性表達,而腎癌組織中DDR2蛋白染色為陰性。DDR2蛋白表達定位于近端腎小管細胞質(zhì)內(nèi)，而在ccRCC中正常的腎小管組織消失而代之以結(jié)構(gòu)紊亂的癌細胞組織，癌細胞核內(nèi)DDR2蛋白明顯降低(圖1)。

A:正常腎臟組織中DDR2呈陽性表達;B～D分別為FuhrmanⅠ、Ⅱ、Ⅲ級ccRCC中DDR2的弱表達或陰性表達圖1 DDR2在癌旁組織及不同ccRCC Furhman分級中的表達情況

二、ccRCC及癌旁組織中DDR2 mRNA的表達

為了進一步了解DDR2表達下降是否與其轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控有關(guān),應用 Real-time PCR方法,檢測12對ccRCC及相應患者的正常腎組織標本DDR2 mRNA的表達變化。結(jié)果在腎癌組織中，DDR2 mRNA的相對表達量(0.006±0.005 3)明顯低于相應的正常腎組織的mRNA表達量(0.014 6±0.006 1)(P<0.05)，且ccRCC組織中DDR2 mRNA只有很微弱的表達(t=3.559,P=0.004 5)。表明ccRCC組織中DDR2 mRNA 的表達水平顯著降低(圖2),差異有統(tǒng)計學意義。提示DDR2基因表達在轉(zhuǎn)錄水平可能受到了抑制。

圖2 ccRCC與正常腎組織 DDR2 mRNA 表達水平比較

三、DDR2表達情況與腎癌患者臨床特征的關(guān)系

DDR2表達情況與腎癌患者臨床特征的關(guān)系見表1。

討 論

RCC是泌尿系常見腫瘤，且其發(fā)病率逐年上升，因此積極尋找協(xié)助RCC早期診斷的分子標志物顯得尤為重要。盡管已有研究發(fā)現(xiàn)不少生物分子標志物與腎腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后存在相關(guān)性，如缺氧誘導因子、血管內(nèi)皮生長因子、碳酸酐酶Ⅸ等[4]，但仍未能明確解釋RCC的發(fā)生、發(fā)展機制。

DDR2蛋白是一種受體型蛋白酪氨酸激酶，能被Ⅰ～Ⅲ、Ⅹ型膠原磷酸化而激活，參與調(diào)控細胞增殖、粘附、遷移及細胞外基質(zhì)重建，在人體多種病理生理過程中都發(fā)揮重要作用。上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是惡性實體瘤中細胞浸潤轉(zhuǎn)移的一個重要途徑，在多種腫瘤的原發(fā)性浸潤和繼發(fā)性轉(zhuǎn)移中都起著舉足輕重的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)在EMT進程中，惡性腫瘤細胞可以獲得更大的侵襲力，更容易侵襲到周圍組織或發(fā)生血流轉(zhuǎn)移。而Walsh 等[5]發(fā)現(xiàn)DDR2及其配體Ⅰ型膠原通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)參與了EMT進程。已有不少研究發(fā)現(xiàn)DDR2在不少腫瘤中差異性表達。在頭頸部鱗癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等一些惡性腫瘤中已發(fā)現(xiàn)DDR2的表達增高，且DDR2的高表達與這些惡性腫瘤的進展和不良預后是密切相關(guān)的[6-9]。Ren等[6]在乳腺癌細胞系中發(fā)現(xiàn)缺氧環(huán)境能增加DDR2的表達和磷酸化水平，體外乳腺癌腫瘤模型實驗得出敲除DDR2后能顯著減少乳腺癌的肺和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)DDR2缺氧環(huán)境下通過激活ERK1/2 MAPK通路在誘導乳腺癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移、侵襲和EMT中發(fā)揮必不可少的作用。DDR2可能作為癌基因在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。

表1 ccRCC中DDR2 蛋白表達與臨床病理學特征的關(guān)系

有不少關(guān)于DDR2在肺癌中表達情況的研究。Ford等[10]利用qRT-PCR實驗研究了146例非小細胞肺癌患者標本中DDR2的表達，發(fā)現(xiàn)DDR2在肺癌中的表達低于正常肺組織。隨后日本學者Sasaki 等[11]對166例非小細胞肺癌患者中DDR2的突變及表達情況進行了研究，他們亦得出DDR2在非小細胞肺癌中的表達是降低的，但是在某些晚期肺癌(8.4%)患者中DDR2的表達水平高于正常肺組織。然而，在RCC中還沒有關(guān)于DDR2表達情況的研究報道。

本研究首次從mRNA及蛋白質(zhì)水平檢測了DDR2在ccRCC及其癌旁正常腎臟組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)DDR2在ccRCC中的表達是降低的，而且DDR2的低表達與ccRCC的臨床進展具有相關(guān)性，且ccRCC的Fuhrman分級和TNM分期越高，DDR2的表達越低。這些都提示DDR2的低表達與腎癌的發(fā)生、發(fā)展具有一定的關(guān)系，我們推測和肺癌中相似，DDR2可能在ccRCC中扮演抑癌基因的角色，但是具體的機制還不明確。

綜上所述，DDR2在ccRCC中的表達明顯低于癌旁正常腎臟組織，且其表達量與腎癌的臨床分期和病理分級呈負相關(guān)，提示DDR2可能在ccRCC中扮演抑癌基因的角色。但是具體的分子機制還需行進一步的實驗研究。另外本實驗樣本量也不大，仍需國內(nèi)外多中心、大樣本的實驗來證實。

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(本文編輯：徐漢玲)

Expression and clinical significance of DDR2 protein in clear cell renal cell cancer

WANGLei*,WANGYang,WUXiao-rong,SHAJian-jun,CHENYong-hui,XUEWei,BOJuan-jie,LIUDong-ming,HUANGYi-ran．*DepartmentofUrology,RenJiHospital,SchoolofMedicineShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200001,China

Correspondingauthor:LIUDong-ming,E-mail:liudm541@126.com

Objective To explore the expression of DDR2 in clear cell renal cell carcinoma(ccRCC) and normal renal tissues,and analysize its clinical significance. Methods The expression of DDR2 protein in specimens of ccRCC and adjacent normal renal tissues were detected by immunohistochemistry and qRT-PCR，their correlations of clinicopathologic features were analyzed． Results DDR2 protein and mRNA levels were abnormally decreased in ccRCC when compared with adjacent normal renal tissues(P<0.05),which showed negative correlation with ccRCC TNM stages and ccRCC clinic stages(P<0.05). Conclusions The expression of DDR2 were decreased in ccRCC and had relationship with clinical stage and histological grade,which indicated that DDR2 may play a role as tumor suppressor gene in ccRCC.However,further studies are needed to confirm these findings.

Clear cell renal cell carcinoma; DDR2; Tumor suppressor genes

200001 上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院泌尿外科(王雷、吳小榮、沙建軍、陳勇輝、薛蔚、薄雋杰、劉東明、黃翼然)；江西省撫州市臨川區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科(王陽)

劉東明，E-mail：liudm541@126.com

10.3870/j.issn.1674-4624.2015.06.010

2015-11-20)