單秀明，楊 曉，邱學偉

(山東省青島市食品藥品檢驗研究院，山東 青島 266071)

跌打片質量標準提高研究

單秀明，楊 曉，邱學偉

(山東省青島市食品藥品檢驗研究院，山東 青島 266071)

目的建立跌打片成分定性、定量分析方法以提高其質量標準。

跌打片；質量控制；薄層色譜法；高效液相色譜法

跌打片是中藥復方制劑，由三七、續(xù)斷、血竭等24味中藥組方，具有活血化瘀、消腫止痛的功效，臨床上用于跌打損傷、筋斷骨折、瘀血腫痛、閃腰岔氣等[1]。該制劑現行標準中只有性狀、顯微鑒別和檢查，但無薄層鑒別及含量測定項。為更好地控制該制劑的內在質量，現建立了鑒別三七、續(xù)斷、血竭等8味藥材的薄層色譜（TLC）法，測定君藥續(xù)斷中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量的高效液相色譜（HPLC）法，現報道如下。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT型高效液相色譜儀，包括真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器及 LC solution色譜工作站；BP211D型電子天平（Sartorius公司）；HHW-4型雙顯恒溫水浴鍋（金壇市雙捷實驗儀器廠）；AUTO Science AS10200BT型超聲波清洗器（杭州匯爾儀器設備有限公司）；硅膠G預制薄層板（德國 MN，批號 707183）。三七對照藥材（批號 120941-200506）、人參皂苷Rb1對照品（批號110704-200420）、三七皂苷 R1對照品（批號110745-200415）、人參皂苷 Rg1對照品（批號110703-200424）、續(xù)斷對照藥材(批號121033-200608）、川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品（批號110708-200505）、芍藥苷對照品(批號110736-200732)、血竭對照藥材（批號120906-200308）、枳實對照藥材（批號 120936-200404）、骨碎補對照藥材（批號121169-200503）、柚皮苷（批號 110722-200610）、橙皮苷（批號110721-200512）、新橙皮苷（批號111857-201102），均購自中國食品藥品檢定研究院；跌打片（批號為 0804001，0804002，0804003，天津中新藥業(yè)有限公司）；乙腈為色譜純，水為純凈水，其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 TLC鑒別

三七、續(xù)斷：取本品15片，除去糖衣，研細，加甲醇50 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次20 mL，正丁醇液再用正丁醇飽和的水 20 mL洗滌，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，得供試品溶液。另取三七、續(xù)斷對照藥材各0.2 g[1-2]，分別加甲醇20 mL，同法得對照藥材溶液。取人參皂苷Rb1對照品、人參皂苷Rg1對照品、三七皂苷R1對照品，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作為對照品溶液。取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。取處方中除去三七的其他藥味，按處方比例制成缺三七的陰性對照樣品；再取處方中除去續(xù)斷的其他藥味，按處方比例制成缺續(xù)斷的陰性對照樣品；按供試品溶液的制備方法分別制成陰性對照品溶液。依據 2010年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB方法，吸取供試品溶液、陰性對照品溶液各1～5 μL，對照藥材溶液與對照品溶液各1 μL，分別點于同一硅膠 G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置的下層溶液為展開劑[3-4]，展開，取出，晾干，噴以 10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，分別置日光及紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材和對照品溶液色譜相應位置顯相同顏色的斑點或熒光斑點，陰性無干擾(見圖1A及圖1B)。

血竭：取本品10片，除去糖衣，研細，加乙醚10 mL，密塞，超聲處理5 min，濾過，濾液作為供試品溶液[5-6]。另取血竭對照藥材0.1 g，同法制成對照藥材溶液。取處方中除去血竭的其他藥味，按處方比例制成缺血竭的陰性對照樣品，同供試品溶液的制備方法制成陰性對照品溶液。吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠 G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(19∶1)為展開劑[4，7]，展開，取出，晾干，噴以2%香草醛硫酸乙醇溶液（1→10），105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色的主斑點，陰性無干擾(見圖2)。

白芍、赤芍、牡丹皮：取本品10片，除去糖衣，研細，加甲醇50 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次30 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次30 mL，棄去水液，正丁醇液回收溶劑至干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，置中性氧化鋁柱（100～200目，5 g，內徑1～1.5 cm）上，用甲醇50 mL洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液[3-4]。另取芍藥苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。取處方中除去牡丹皮、白芍、赤芍的其他藥味，按處方比例制成缺牡丹皮、白芍、赤芍的陰性對照樣品，同供試品溶液的制備方法制成陰性對照品溶液。吸取上述3種溶液各2～5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品色譜相應位置顯相同顏色的斑點，陰性無干擾(見圖3)。

圖1 三七及續(xù)斷薄層色譜圖

圖2 血竭薄層色譜圖

圖3 牡丹皮、白芍、赤芍薄層色譜圖

枳實、骨碎補：取本品2片，除去糖衣，研細，加甲醇15 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液作為供試品溶液。另取枳實對照藥材0.02 g、骨碎補對照藥材0.04 g，同法分別制成對照藥材溶液。取橙皮苷對照品、新橙皮苷對照品、柚皮苷對照品，分別加甲醇制成每1 mL各含0.05 mg的溶液，作為對照品溶液[8-9]。再取處方中除去枳實、骨碎補的其他藥味，按處方比例制成缺枳實、骨碎補的陰性對照樣品。同供試品溶液的制備方法制成陰性對照品溶液。吸取上述7種溶液各2 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷-丙酮-甲醇(5∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈(365 nm)下檢視[3]。供試品溶液色譜中，在與對照藥材和對照品溶液色譜相應位置，顯相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾(見圖4)。

圖4 枳實、骨碎補薄層色譜圖

2.2 川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量測定

2.2.1 色譜條件[1，10-11]

色譜柱：KromasilTMC18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水，梯度洗脫，0～20 min流動相A 20%→40%、流動相B 80%→60%，20～35 min流動相 A 20%、流動相 B 80%；流速：1.0 mL/min；檢測波長：212 nm；柱溫：35℃；進樣量：20 μL。

2.2.2 溶液制備

精密稱取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品適量，加甲醇溶解制成每1 mL含川續(xù)斷皂苷Ⅵ70 μg，即得對照品溶液。取本品20片，除去糖衣，精密稱定，研細，取0.15 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理（功率 300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方比例取除續(xù)斷的其余藥材，按供試品制備工藝、供試品溶液的制備方法，得陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性考察：照擬訂色譜條件，分別精密吸取2.2.2項下3種溶液各20 μL，注入液相色譜儀。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置有一相同的色譜峰，而陰性樣品溶液色譜則無此峰，說明其他組分對待測成分的測定無干擾。色譜圖見圖5。

線性關系考察：精密稱取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品18.57 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為對照品溶液，各進樣5，10，15，20，25，30，35 μL，注入高效液相色譜儀，依法測定，記錄色譜圖。以對照品溶液質量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，線性回歸方程為 Y=14 579 X-756.24，r= 0.999 9（n=7）。結果表明，川續(xù)斷皂苷Ⅵ進樣量在 0.347 3～2.430 8 μg范圍內與峰面積呈良好線性關系。

精密度試驗：精密吸取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品溶液 20 μL，重復進樣6次。結果的 RSD為0.13%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取同一供試品（批號為 084001）溶液20 μL，在相同的色譜條件下于0，3，7，10，13，15 h時測定。結果的RSD為0.87%（n=6），表明供試品溶液于15 h內基本穩(wěn)定。

圖5 高效液相色譜圖

重復性試驗：稱取樣品（批號為084001）共6份，精密稱定，依法測定川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量。結果的 RSD為0.95%（n=6），表明方法重復性較好。

加樣回收試驗：取已知含量的同一批樣品（批號為084001）20片，除去糖衣，精密稱定，研細。精密稱取3組（每組3份）已知含量的供試品粉末0.05，0.07，0.09 g，分別加入一定量川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品，按擬訂色譜條件測定，計算回收率。結果見表1。

表1 川續(xù)斷皂苷Ⅵ加樣回收試驗結果（n=9）

2.2.4 樣品含量測定

取3批跌打片樣品(批號為0804001，0804002，0804003），依法測定，結果3批樣品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量分別為每片4.1，4.0，4.0 mg。

3 討論

關于展開劑的選擇，分別選用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）10℃以下放置的下層溶液[3]、正丁醇-醋酸-水（4∶1∶5）[3]、三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置的下層溶液[4]3種不同的展開劑，經過大量試驗，最終選擇三氯甲烷 -甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置的下層溶液作為展開劑，分離效果較好，陰性無干擾，且可同時鑒別三七、續(xù)斷2味藥材，避免造成結果誤判。

通過對比試驗發(fā)現，相對濕度應在60%以下，且相對濕度越低,三七皂苷R1與川續(xù)斷皂苷Ⅵ分離效果越好。三七、續(xù)斷供試品點樣量為 5 μL時，更易觀察到三七皂苷R1的斑點；點樣量為1 μL時，供試品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的理論含量與續(xù)斷對照藥材基本相當，更便于川續(xù)斷皂苷Ⅵ斑點的觀察。故建議操作者根據樣品實際情況，在同一薄層板上采用不同點樣量試驗。

血竭為進口貴重藥材，由于進口藥材來源有限，中藥材市場常有偽劣品出現[5]。為有效控制跌打片中血竭的投料質量，建立了以2%香草醛硫酸乙醇溶液（1→10）為顯色劑的薄層色譜定性研究方法。結果表明，經顯色的供試品溶液色譜圖中血竭的特征斑點清晰，陰性無干擾，明顯優(yōu)于其他方法[1]，快速、有效、靈敏度高、專屬性強。

白芍、赤芍和牡丹皮的鑒別試驗結果表明，三者均可檢出丹皮酚，且除去上述藥材所得到的陰性對照品溶液的色譜圖對丹皮酚的檢出存在干擾。為初步控制3味藥材的投藥質量，最終以芍藥苷作為對照品，對處方中白芍、赤芍、牡丹皮投藥情況進行定性考察，具有一定的實際意義。

枳實、骨碎補的TLC鑒別試驗中，采用聚酰胺薄膜作為薄層板，以三氯甲烷-丙酮 -甲醇(5∶1∶1)為展開劑[1]，對同時鑒別枳實、骨碎補中的橙皮苷、新橙皮苷與柚皮苷等活性成分有良好的色譜分離效果，明顯優(yōu)于其他方法[4]。分離效果好、靈敏度高、專屬性強。

關于含量測定中流動相的選擇，最初以乙腈-水（30∶70）為流動相，由于本組方藥味多，干擾嚴重，未取得滿意的分離效果。根據樣品的分離情況，參照文獻[1，10-11]，最終選擇梯度洗脫，分離效果良好。

[1]WS3-B-3001-98，衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑（第15冊）·跌打片[S].

[2]張 丹，曹緯國，陶燕鐸.不同炮制方法對續(xù)斷中總皂苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量的影響[J].重慶醫(yī)科大學學報，2010，35（7）：1 054-1 057.[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄ⅥB.

[4]呂武清，龍新華.中成藥中的藥材薄層色譜鑒別[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1997：12-13.

[5]葛美婷，胡雙豐.血竭與龍血竭的定性鑒別[J].中國藥業(yè)，2010，19（22）：85.

[6]吳敏姿，吳 鋒，葉端爐.大七厘散中血竭、大黃的薄層色譜鑒別[J].中國藥業(yè)，2005，14（10）：64-65.

[7]胡穎菲，陸兔林，毛春芹，等.大柴胡顆粒質量標準研究[J].中成藥，2013，35（1）：68-73.

[8]高 穎，房德敏.骨碎補黃酮類化合物的研究進展與開發(fā)前景[J].中草藥，2009，40（2）：161-164.

[9]黃愛華，曹 騁，曾元兒，等.HPLC法測定不同規(guī)格酸橙枳實中新橙皮苷和柚皮苷的含量[J].藥物分析雜志，2009，9（29）：48-50.

[10]楊武德，彭嬌平，馮 靜.高效液相色譜法測定不同產地續(xù)斷中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2011，31(17)：1 469-1 471.

[11]劉京晶，郭寶林，黃文華，等.HILIC-HPLC測續(xù)斷藥材中多種皂苷含量[J].中國中藥雜志，2011，36(17)：2 367-2 371.

Study on the Quality Standard of Dieda Tablets

Shan Xiuming,Yang Xiao,Qiu Xuewei
(Qingdao Institute for Drug and Food Control,Qingdao,Shandong,China 266071)

Objective To establish the qualitative and quantitative methods to improve its quality standard of Dieda Tablets.Methods TLC was applied to the identification of Notoginseng Radix et Rhizoma,Dipsaci Radix,Draconis Sanguis,Paeonia Radix Alba,Paeonia Radix Rubra,Moutan cortex,Aurantii Fructus ImmaTurus and Drynaria Rhizoma;HPLC was applied to determinte asperosaponin VI;the analytical column was KromasilTMC18column(150 mm×4.6 mm,5μm);the mobile phase was acetonitrile-water at the flow rate of 1.0 mL/min;the detection wavelength was 212 nm;and the column temperature was 35℃.Results The spots in the TLC were clear and could be well separated,the blank test showed that other medicine herbs had not interference with the main one;The calibration curve of asperosaponin VI showed good linearity in the range of 0.347 3-2.430 8 μg(r=0.999 9).The average recovery was 99.14%,RSD was 1.34%(n=9).Conclusion The established methods are accurate,reliable,specific and with good reproducibility.It can be used for the quality control of the Dieda Tablets.

Dieda Tablets;quality standard;TLC;HPLC

R286.0；R284.1

A

1006-4931(2015)19-0041-03

單秀明（1970-），女，大學本科，主管藥師，主要從事中成藥質量控制研究，（電子信箱）shanxium＠163.com。

2014-10-27；

2015-03-20)

方法 采用薄層色譜（TLC）法，建立跌打片中三七、續(xù)斷、血竭、白芍、赤芍、牡丹皮、枳實和骨碎補的定性分析方法；采用高效液相色譜（HPLC）法測定川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量，色譜柱為KromasilTMC18柱(150 mm×4.6 mm，5 βm)，流動相為乙腈-水(梯度洗脫)，流速1.0 mL/min，檢測波長212 nm，柱溫35℃。結果TLC鑒定組成斑點清晰，陰性無干擾；川續(xù)斷皂苷Ⅵ進樣量在0.347 3～2.430 8 βg范圍內與峰面積呈良好的線性關系（r=0.999 9），平均加樣回收率為99.14%，RSD為1.34%（n=9）。結論該法準確可靠、專屬性強、重復性好，能有效地控制跌打片的內在質量。