康康,王藹明,尹善德,趙勇,王明凱,黃紹敏
間充質(zhì)干細(xì)胞(m esenchym al stem cells,MSCs)屬于成體干細(xì)胞,是一種具有自我更新和多向分化能力的多能細(xì)胞[1],子宮內(nèi)膜干細(xì)胞在2004年被發(fā)現(xiàn)并分離出來(lái),目前已應(yīng)用于多種臨床試驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[2-4]。雖然子宮內(nèi)膜再生能力強(qiáng),其應(yīng)用價(jià)值已得到一定程度的肯定,但畢竟數(shù)量有限,而子宮結(jié)合帶組織標(biāo)本充足,與子宮內(nèi)膜具有相似性[5]和相同的胚胎起源[6-7],其厚度變化與子宮內(nèi)膜一樣具有周期性,且探索子宮結(jié)合帶組織中是否含有MSCs具有重要意義。近年來(lái),有學(xué)者提出子宮內(nèi)膜異位癥(EH)的干細(xì)胞學(xué)說(shuō),認(rèn)為EH病灶中的終末細(xì)胞不能維持病灶的長(zhǎng)期發(fā)展[8-10],且已有研究發(fā)現(xiàn)EH患者子宮結(jié)合帶的厚度發(fā)生改變,甚至有學(xué)者提出可通過(guò)結(jié)合帶的厚度改變來(lái)診斷EH[11]。若子宮結(jié)合帶中含有MSCs,即子宮結(jié)合帶干細(xì)胞(uterine junctional zone stem cells,uJZSCs),其是否參與了EH的發(fā)生發(fā)展仍有待探究。本研究觀察子宮結(jié)合帶細(xì)胞形態(tài),貼壁情況,表面標(biāo)志物表達(dá)情況,細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特征以及成脂、成骨誘導(dǎo)分化能力,旨在綜合評(píng)估子宮結(jié)合帶是否可作為MSCs的來(lái)源。
1.1 樣本來(lái)源及處理 子宮結(jié)合帶組織由海軍總醫(yī)院手術(shù)室提供,均取自育齡期女性,年齡30~52歲,因子宮肌瘤、宮頸癌、卵巢癌而行子宮切除術(shù)(術(shù)前3個(gè)月內(nèi)未服用激素類(lèi)藥物)。所取組織均遠(yuǎn)離患處2cm以上,首先去除子宮內(nèi)膜組織,用無(wú)菌生理鹽水反復(fù)沖洗后,獲取子宮結(jié)合帶組織(均由病理學(xué)證實(shí)[12]),置入無(wú)菌生理鹽水中,2h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。所有子宮結(jié)合帶組織均經(jīng)病理檢查排除子宮內(nèi)膜,標(biāo)本留取經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),征得患者同意并簽署知情同意書(shū)。
樣本的處理及培養(yǎng):樣本送至實(shí)驗(yàn)室后,用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)洗滌,直至去除紅細(xì)胞,將標(biāo)本剪成10mm3小塊,加入2倍體積0.25%胰酶,置于37℃水浴箱中消化30m in,加入等體積含10% FBS的IMDM培養(yǎng)基中止消化。以2500r/m in離心10m in,并用PBS洗滌2次,加入2倍體積0.1%膠原酶Ⅰ消化2h,2000r/m in離心8m in,用PBS清洗2次后接種到培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng),72h后半量更換培養(yǎng)基,之后每周更換2次。
1.2 試劑與儀器 IMDM培養(yǎng)基及試劑購(gòu)于Gib co公司,胎牛血清(FBS)購(gòu)于四季清公司,CCK-8試劑盒購(gòu)于Do jindo公司,CD13-FITC、CD29-APC、CD44-PE、CD90-FITC、CD14-APC、CD19-APC、CD34-PE、CD45-FITC、CD73-PE、CD105-PercP、CD166-PE、HLA-DR-APC、HLA-ABC-FITC購(gòu)于BD公司。流式細(xì)胞儀(型號(hào)為BD FACS Calibu r)購(gòu)于BD公司。
1.3 u JZSCs形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞接種后72h半量換液,7d后全量換液,去除未貼壁細(xì)胞,待細(xì)胞融合程度達(dá)80%~90%時(shí),用0.125%胰酶消化后傳代,并于每一代傳代前用倒置顯微鏡拍照記錄。
1.4 u JZSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物分析 取第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行免疫表型分析,鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞為MSCs,用0.1%胰酶消化并采集細(xì)胞,制成1×106/m l的單細(xì)胞懸液,分別向預(yù)先加入抗體CD13-FITC、CD29-APC、CD44-PE、CD90-FITC、CD14-APC、CD19-APC、CD 34-PE、CD 45-FITC、CD73-PE、CD105-PercP、CD166-PE、HLA-DR-APC、HLAABC-FITC的Falcon管各加100μl細(xì)胞懸液,以大鼠IgG1-FITC、IgG1-APC、IgG1-PE、IgG1-PercP為陰性對(duì)照。避光孵育20m in,PBS洗滌2次,重懸后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。采用CellQuest Pro對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
1.5 u JZSCs細(xì)胞存活率測(cè)定 取第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,0.1%胰酶消化,采集細(xì)胞,制成1×106/m l單細(xì)胞懸液,重懸,加7-AAD染色,渦旋震蕩均勻,避光15m in,PBS洗滌2次后,4℃避光保存,立即用流式細(xì)胞儀(型號(hào)為BD FACS Calibu r)進(jìn)行檢測(cè)。采用CellQuest Pro對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
1.6 u JZSCs細(xì)胞周期測(cè)定 取第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,0.1%胰酶消化后采集細(xì)胞,制成1×106/m l的單細(xì)胞懸液,向Falcon管中加入-20℃預(yù)冷的75%乙醇2m l,再迅速加入100μl細(xì)胞懸液,渦旋震蕩均勻,-20℃放置3h。將固定好的細(xì)胞1500r/m in離心5m in,棄上清;渦旋震蕩均勻,加入RNaseA(20m g/m l)10μl,37℃水浴30m in;水浴后將樣品置于4℃冰箱10m in終止酶反應(yīng);加入5μl的碘化丙啶(PI)溶液,4℃避光孵育30m in;渦旋震蕩均勻,離心,4℃避光保存,3h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。采用CellQuest Pro對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
1.7 u JZSCs生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定 將第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以1×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板,設(shè)置4個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔,分別于第1~8天同一時(shí)間加入10μl CCK-8,孵育2h后用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè),在450nm條件下檢測(cè)吸光度(A)值,并繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。
1.8 u JZSCs誘導(dǎo)分化能力鑒定 成脂分化:將P5代細(xì)胞按照2.1×106/cm2密度接種,置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng),待細(xì)胞完全融合后更換成脂分化完全培養(yǎng)基A,72h后更換成脂分化誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基B,如此循環(huán)3~5次后,用成脂分化誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基B繼續(xù)維持7d,每3d換液1次;分化誘導(dǎo)完成后固定,油紅O染色,光鏡下觀察并拍照。
成骨分化:將P5代細(xì)胞按照3.1×103/cm2密度接種,置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng),直至間質(zhì)干細(xì)胞達(dá)到50%~70%融合,然后更換成成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基,每3d換液1次;分化誘導(dǎo)完成后固定,茜素紅染色,光鏡下觀察并拍照。
成軟骨誘導(dǎo)分化:將P5代細(xì)胞按照5×105/m l密度加入成軟骨分化培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,吸取10μl滴到6孔板上,放置24h后加入新鮮的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基,21d后用阿利信藍(lán)染色,光鏡下觀察并拍照。1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示,組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 u JZSCs的形態(tài)學(xué)特點(diǎn) 原代細(xì)胞接種后第3天半量換液,可見(jiàn)少量貼壁細(xì)胞;于第7天全量換液,此后細(xì)胞迅速貼壁,細(xì)胞集落明顯增大、增多,接種后第10~14天細(xì)胞達(dá)80%~90%融合。傳代后細(xì)胞3~6h貼壁,細(xì)胞融合并呈長(zhǎng)梭形,漩渦狀生長(zhǎng),3~4d后細(xì)胞傳代(圖1)。
2.2 u JZSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物分析 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,第3代u JZSCs表面標(biāo)志物CD90、CD73、CD105、CD29、CD44、CD13、CD166、HLA-ABC的表達(dá)呈陽(yáng)性,而造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD45、CD14、HLA-DR、CD19呈陰性表達(dá)(圖2)。
2.3 u JZSCs細(xì)胞存活率分析 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,u JZSCs細(xì)胞存活率(94.32%±0.96%)較高,細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好,適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)(圖3)。
圖1 u JZSCs的P0(A、B)和P3(C、D)代細(xì)胞(×100)Fig.1 u JZSCs at passage 0 (A and B) and passage 3 (C and D) (×100)
圖2 u JZSCs表面標(biāo)志物表達(dá)Fig.2 Exp ression of cell su rfactan ts in cu ltu red u JZSCs (Flow cytom etry)
圖3 u JZSCs細(xì)胞活率檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Cell viab ility of cu ltu red EnMSCs (Flow cytom etry)A. Ce ll d istribu tion; B. Histog ram of ce ll viab ility; C. Scatterp lo t of ce ll viab ility
2.4 u JZSCs細(xì)胞周期分析 采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各周期細(xì)胞的百分比,結(jié)果顯示處于DNA合成期的細(xì)胞比例較高(G2+S期為30.3%),u JZSCs的增殖能力相對(duì)較強(qiáng)(圖4)。
2.5 u JZSCs細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn) 細(xì)胞傳代后,增殖曲線(xiàn)呈S型,1~3d生長(zhǎng)速度較慢,屬于潛伏期,4~6d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,于7~9d進(jìn)入平臺(tái)期,此時(shí)細(xì)胞已達(dá)到90%~95%融合(圖5)。
圖4 u JZSCs細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Cell cycle analysis of u JZSCs (Flow cytom etry)
圖5 u JZSCs細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.5 The grow th curve of u JZSCs in p resent experim ent
2.6 u JZSCs成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化結(jié)果成脂分化:u JZSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)分化21d后,油紅O染色倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)中充滿(mǎn)紅色的油滴(圖6A)。成骨分化:u JZSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化21d后,采用茜素紅進(jìn)行鈣化結(jié)節(jié)染色,可見(jiàn)致密生長(zhǎng)的細(xì)胞中散在出現(xiàn)大小不一的橘紅色礦化結(jié)節(jié)(圖6B)。成軟骨分化:u JZSCs經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)分化21d后,采用阿利辛藍(lán)對(duì)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行染色,可見(jiàn)大小不一的藍(lán)色結(jié)節(jié)(圖6C)。
圖6 光鏡下觀察u JZSCs的誘導(dǎo)分化(×100)Fig.6 Induced d ifferen tiations of u JZSCs (×100)A. Ad ipogenic (Oil red O); B. Osteogenic (Alizarin red); C. Chond rogen ic (Alcian b lue)
骨髓是基礎(chǔ)研究和臨床治療所用MSCs的主要來(lái)源之一,但是獲取骨髓MSCs是有創(chuàng)的,且所獲細(xì)胞數(shù)量非常有限[13-15]。因此,人們一直在從更方便獲得和更優(yōu)質(zhì)兩方面努力尋找替代骨髓MSCs的新來(lái)源[16]。目前已從一些廢棄的組織,例如脂肪、乳牙、胎盤(pán)和臍帶中發(fā)現(xiàn)了M SCs[17],但是這些MSCs是否可應(yīng)用于臨床治療,以及如何從這些新來(lái)源中選出更優(yōu)質(zhì)的MSCs仍有待探索。
本實(shí)驗(yàn)的取材主要是子宮肌層的內(nèi)1/3,即子宮結(jié)合帶,又稱(chēng)黏膜下肌層[18],其平滑肌束與內(nèi)膜基底層平行走行。核磁共振上顯示的子宮結(jié)合帶是分辨清晰的低信號(hào)帶影像,與結(jié)合帶內(nèi)側(cè)的內(nèi)膜高信號(hào)影像和結(jié)合帶外側(cè)的子宮外肌層中等信號(hào)影像界限清楚[19]。雖然子宮內(nèi)膜MSCs具有高度增殖能力及自我更新分化潛能[20],且近年來(lái)因子宮肌瘤、宮頸癌、卵巢癌等婦科疾病切除子宮的患者也逐漸增多,但是從子宮內(nèi)膜基底層獲得的細(xì)胞仍很有限,且子宮內(nèi)膜與外界相通,容易發(fā)生污染,尤其是對(duì)于陰道炎和宮頸HPV感染的患者,而子宮結(jié)合帶部分占子宮組織的1/3,是充足的組織來(lái)源,可以獲得足夠用于干細(xì)胞治療的細(xì)胞數(shù)量且不易發(fā)生污染。
本研究結(jié)果顯示,u JZSCs呈梭形、放射狀生長(zhǎng),貼壁能力強(qiáng),MSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)多數(shù)在90%以上,成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化能力強(qiáng),從而證實(shí)從子宮結(jié)合帶分離出來(lái)的細(xì)胞為MSCs,符合國(guó)際鑒定MSCs的標(biāo)準(zhǔn)[1]。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞活率數(shù)據(jù)穩(wěn)定,以細(xì)胞的流速評(píng)價(jià)細(xì)胞數(shù)量,聯(lián)合使用區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞的染料,可用于細(xì)胞存活率的測(cè)定[21]。從本研究結(jié)果來(lái)看,細(xì)胞成活率很高,為94.32%±0.96%,比較容易適應(yīng)環(huán)境;從細(xì)胞周期結(jié)果來(lái)看,處于G2+S期的細(xì)胞百分比高,具有較強(qiáng)的增殖能力,在培養(yǎng)過(guò)程中,死亡細(xì)胞及細(xì)胞碎片少,是干細(xì)胞治療較為理想的來(lái)源。
綜上所述,本研究結(jié)果表明,可成功從子宮結(jié)合帶中分離出u JZSCs,且該干細(xì)胞表達(dá)典型的MSCs表面抗原,具有較強(qiáng)的增殖能力以成脂、成骨、成軟骨分化特性。此外,u JZSCs還具有組織充足,易分離,不易污染等優(yōu)勢(shì)。對(duì)于u JZSCs的研究,目前尚處于起步階段,相關(guān)研究仍有待進(jìn)一步深入。
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