溫麗君，吳繼華，宋淑軍，王艷茹，劉俊麗，司少艷，崔彥，張建中，周金蓮

機(jī)體在失重或模擬失重環(huán)境下可出現(xiàn)心血管脫適應(yīng)癥[1]，主要表現(xiàn)為心動(dòng)過(guò)速、血壓下降甚至?xí)炟?。研究表明，失重或模擬失重條件下的心血管脫適應(yīng)與機(jī)體血液循環(huán)中腎上腺髓質(zhì)激素的變化有關(guān)，但具體機(jī)制尚不明確[2]。腎上腺髓質(zhì)激素主要包括多巴胺(dopam ine，DA)、去甲腎上腺素(norep inephrine，NE)和腎上腺素(epinephrine，E)，機(jī)體處于安靜狀態(tài)時(shí)，髓質(zhì)激素分泌量很少，而處于緊急情況時(shí)交感神經(jīng)興奮，髓質(zhì)激素分泌可驟然增多，使神經(jīng)興奮，反應(yīng)靈敏，供氧、供血增加，血糖升高，糖和脂肪分解加速，以供給更多的能量，提高機(jī)體的應(yīng)激能力。酪氨酸羥化酶(tyrosine hyd roxy lase，TH)是腎上腺髓質(zhì)激素合成過(guò)程中的限速酶，其活性對(duì)NE和E的合成起關(guān)鍵作用。文獻(xiàn)報(bào)道航天員在航天飛行過(guò)程中血漿腎上腺髓質(zhì)激素水平波動(dòng)明顯且不一致，其在模擬失重條件下的變化亦存在爭(zhēng)議[3-5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，m iRNA-375在腎上腺髓質(zhì)中表達(dá)，而在皮質(zhì)中不表達(dá)。因此，本研究探討模擬失重條件下大鼠血漿腎上腺髓質(zhì)激素、TH及m iRNA-375表達(dá)變化特點(diǎn)，探討其m iRNA-375表達(dá)對(duì)腎上腺髓質(zhì)激素合成與分泌的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SPF級(jí)W istar成年雄性大鼠56只，體重280～350g，購(gòu)自中國(guó)北京華阜康生物科技股份有限公司。飼養(yǎng)條件為人工控制22±2℃，12h晝夜光照，自由進(jìn)食飲水。適應(yīng)飼養(yǎng)1周后將大鼠隨機(jī)分為0h(正常對(duì)照組)、6h、12h、1d、3d、5d、7d組(n=8)。采用Morey-Holton尾懸吊法[6]建立模擬失重動(dòng)物模型，所有操作經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)步驟參照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[7]。實(shí)驗(yàn)前后測(cè)量體重。除6、12h組外，其余各組選擇在9:00am取材。利用眼球摘除法取血標(biāo)本，摘取腎上腺，剝除脂肪，測(cè)重，左側(cè)腎上腺置于1.5m l EP管中–80℃冰箱保存，右側(cè)腎上腺置于pH 7.4多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋。

1.2 大鼠血漿腎上腺髓質(zhì)激素測(cè)定 大鼠懸吊結(jié)束后，采用10%水合氯醛行腹腔麻醉，利用眼球摘除法取血，置于含20μl 10% EDTA的滅菌EP管中，室溫靜置30m in，3500r/m in離心10m in，收集上層血漿，–20℃冰箱保存，利用放射免疫分析法測(cè)定血漿腎上腺髓質(zhì)激素含量，所有操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 免疫組化檢測(cè)腎上腺髓質(zhì)TH蛋白表達(dá) 腎上腺石蠟包埋切片后，采用SABC法行免疫組化檢測(cè)。具體步驟如下：切片脫蠟，高溫抗原修復(fù)，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，羊血清封閉非特異性抗原，加TH一抗(以PBS為對(duì)照)，4℃孵育過(guò)夜，加二抗GAR-B(生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG)室溫孵育3h，加SP-HR室溫孵育2h，DAB試劑盒顯色，脫水封固，顯微鏡下觀察并照相。TH陽(yáng)性為胞質(zhì)著色，DAB染色為棕黃色或棕褐色。

1.4 Western blotting檢測(cè)腎上腺髓質(zhì)TH蛋白表達(dá)水平 取凍存腎上腺，加入200μl蛋白裂解液，冰上研磨至糊狀，反復(fù)凍融6次，每次2m in，4℃條件下12 000r/m in離心60m in，取上清，按BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)其濃度并分裝，–80℃保存。SDS-PAGE凝膠電泳，采用半干法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用脫脂奶粉封閉液封閉2h，稀釋抗體，室溫下與膜孵育2h，TBST快速洗膜6次，稀釋二抗并與膜孵育2h，再次用TBST快速洗滌膜6次，AP試劑盒顯色并照相。

1.5 RT-PCR檢測(cè)腎上腺髓質(zhì)TH m RNA和m iRNA-375表達(dá) 根據(jù)Gen Bank設(shè)計(jì)引物序列如下。TH上游引物5'-CCTCCTTGTCTCGGGCTGTA-3'，下游引物5'-GGCGAGCACAGTAATCACCTTC-3'；GAPDH上游引物5'-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3'，下游引物5'-GGGTGGTCCAGGGTTTCTTA-3'；m iRNA-375上游引物5'-AGTGTCGTCAGAAAGAACGAACGGC-3'，下游引物5'-CTCAACTGGTGCGTGGAGTC-3'；U6上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。m iRNA反轉(zhuǎn)錄引物序列：m iRNA-375-RT：CTCAACTGGTGTCGTG GAGTCGGCAATTCAATTCAGTTGAGAGCGCACT；U6-RT：AACGCTTCACGAATTTGCGT。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。提取組織RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR反應(yīng)體系為15μl，上、下游引物分別為0.3μl。PCR反應(yīng)條件為95℃ 30s，95℃5s，60℃ 34s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后記錄Ct值，根據(jù)熔解曲線判斷所提取產(chǎn)物的純度并計(jì)算TH和m iRNA-375的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)采用±s表示，正態(tài)分布及方差齊性檢驗(yàn)后，多個(gè)樣本比較采用單因素方差分析，多個(gè)均數(shù)之間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)或SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血漿腎上腺髓質(zhì)激素水平測(cè)定 尾懸吊模擬失重條件下，大鼠血漿腎上腺髓質(zhì)激素含量波動(dòng)明顯，6～12h出現(xiàn)一過(guò)性下降，隨后急劇升高，3d形成峰值，之后呈下降趨勢(shì)，7d時(shí)接近正常對(duì)照組水平。E和NE變化趨勢(shì)基本一致，但前者反應(yīng)超前。尾懸吊1～5d大鼠E含量及尾懸吊3～5d大鼠的NE含量顯著升高，與正常對(duì)照(尾懸吊0h)之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。DA的波動(dòng)幅度相對(duì)較小，僅3d組的含量與正常對(duì)照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1)。

圖1 模擬失重情況下各組大鼠血漿腎上腺髓質(zhì)激素含量變化Fig.1 Effect of sim u la ted nu ll g ravity on p lasm a m edu lliad renal ho rm one of rats

2.2 免疫組化染色觀察TH蛋白表達(dá) TH蛋白陽(yáng)性表達(dá)胞質(zhì)呈棕褐色。正常對(duì)照組大鼠腎上腺髓質(zhì)胞質(zhì)染色為陽(yáng)性(圖2A、2B)，6h～1d各組大鼠腎上腺髓質(zhì)胞質(zhì)染色加深(圖2C、2D)，3d組染色最強(qiáng)(圖2E、2F)，7d組染色逐漸恢復(fù)。陰性對(duì)照組腎上腺髓質(zhì)和皮質(zhì)的胞核及胞質(zhì)均未見(jiàn)著色(圖2G、2H)。

2.3 大鼠腎上腺髓質(zhì)TH m RNA和蛋白表達(dá)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，各組大鼠腎上腺組織TH m RNA表達(dá)波動(dòng)明顯，6h時(shí)呈現(xiàn)一過(guò)性下降，隨后即上升，1d到達(dá)峰值，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，之后呈下降趨勢(shì)，5d時(shí)形成谷值，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，7d時(shí)又有所升高。Western b lotting檢測(cè)結(jié)果顯示，3d時(shí)TH蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較顯著升高(P＜0.05)，其余各組蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。TH m RNA和蛋白表達(dá)趨勢(shì)一致，但TH蛋白表達(dá)強(qiáng)度相對(duì)滯后(圖3)。

圖2 免疫組化染色觀察模擬失重大鼠腎上腺髓質(zhì)內(nèi)TH蛋白表達(dá)(DAB)Fig.2 Exp ression of TH p rotein in ad renal m edulla of rats under simulated null gravity (Immunohistochem istry staining,DAB)

2.4 大鼠腎上腺髓質(zhì)m iRNA-375表達(dá) 各組大鼠腎上腺髓質(zhì)m iRNA-375表達(dá)水平波動(dòng)明顯，表現(xiàn)為尾懸吊早期(6h)呈一過(guò)性顯著升高，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；隨后快速下降，12h、1d和3d時(shí)表達(dá)受到明顯抑制，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；5d時(shí)表達(dá)量增加，7d時(shí)顯著升高(P＜0.05，圖4)。

3 討 論

航天員飛行及模擬失重環(huán)境中腎上腺髓質(zhì)功能的變化情況，已受到學(xué)術(shù)界的關(guān)注。相關(guān)研究證實(shí)，航天員在航天飛行過(guò)程中血漿及尿腎上腺髓質(zhì)激素的檢測(cè)結(jié)果波動(dòng)明顯且不一致，不僅不同飛行任務(wù)中航天員體內(nèi)腎上腺髓質(zhì)激素的量升降不一，同一飛行乘組中航天員之間的變化也不盡相同[5,8]。在人體模擬失重實(shí)驗(yàn)中，研究結(jié)果則較為一致，表現(xiàn)為血漿或尿中腎上腺髓質(zhì)激素量下降[9-10]。

圖3 各組大鼠腎上腺髓質(zhì)TH m RNA(A)和蛋白(B)表達(dá)變化Fig. 3 Effect of sim u lated nu ll g ravity on m RNA (A) and p ro tein (B) exp ression of TH in ad renal m edu lla in rats(1)P＜0.05 com pared with 0h (control group); (2)P＜0.05 com pared with 6h group; (3)P＜0.05 com pared with 12h group; (4)P＜0.05 com pared with 1d g roup; (5)P＜0.05 com pared with 3d g roup

圖4 大鼠腎上腺髓質(zhì)m iRNA-375水平變化Fig.4 Changes of m iRNA-375 exp ression in adrenal medulla of rats(1)P＜0.05 com pared with 0h (con tro l group); (2)P＜0.05 com pared with 6h group; (3)P＜0.05 com pared with 12h group; (4)P＜0.05 com pared with 1d group; (5)P＜0.05 com pared with 3d group;(5)P＜0.05 com pared with 5d g roup

模擬失重條件下大鼠體內(nèi)腎上腺髓質(zhì)激素變化的研究結(jié)果存在爭(zhēng)議。范全春等[11]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠尾懸吊21d后血清中NE含量明顯增加，Macho等[12]也有同樣結(jié)論，這與陳杰等[13]報(bào)道長(zhǎng)期尾懸吊大鼠血漿中NE含量明顯下降矛盾，可能與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、環(huán)境、時(shí)相、檢測(cè)方法等的不同有關(guān)。我們的研究結(jié)果顯示，大鼠血漿中NE、E水平在尾懸吊早期呈現(xiàn)一過(guò)性下降，隨后急劇升高，3d時(shí)達(dá)高峰，之后下降，至7d時(shí)接近正常對(duì)照組水平。這種明顯的波動(dòng)，首先可能與大鼠姿勢(shì)改變、體液重新分配、頭部及上肢血液瞬間增加、刺激心肺壓力感受器進(jìn)而導(dǎo)致交感神經(jīng)活性暫時(shí)受到抑制有關(guān)；伴隨持續(xù)的失重應(yīng)激狀態(tài)，機(jī)體交感神經(jīng)活性的一過(guò)性抑制解除后，腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞活性和腎上腺髓質(zhì)激素的合成及分泌迅速增加；一旦機(jī)體從整體到各系統(tǒng)尤其心血管系統(tǒng)對(duì)失重環(huán)境逐漸適應(yīng)后，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)包括腎上腺髓質(zhì)激素的合成和分泌變化則趨向穩(wěn)定，這種變化符合機(jī)體的正常應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程。

Le lkes等[14]研究發(fā)現(xiàn)，SD大鼠搭載太空飛船STS-54飛行6h后，其髓質(zhì)中腎上腺髓質(zhì)激素下降的同時(shí)伴隨TH表達(dá)水平的降低，但多巴胺β-羥化酶(dopam ine β hyd roxylase，DBH)及苯乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(phenylethanolam ine N-m ethyltransferase，PNM T)水平無(wú)明顯改變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠血漿TH m RNA及蛋白在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中波動(dòng)明顯，二者之間及與NE和E的變化趨勢(shì)基本一致，進(jìn)一步說(shuō)明模擬失重早期血漿腎上腺髓質(zhì)激素的一過(guò)性下降和隨后的明顯升高以及后期的變化趨緩均受到TH的嚴(yán)密調(diào)控。

m iRNA-375最初發(fā)現(xiàn)于胰腺β細(xì)胞[15]，隨后研究表明其在神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等組織中均有表達(dá)，并通過(guò)不同的靶基因抑制下游網(wǎng)狀細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮作用，尤其與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[16]。在機(jī)體多系統(tǒng)組織的增殖和分化過(guò)程中也有重要作用，包括影響脂肪細(xì)胞分化、神經(jīng)突分化、軟骨祖細(xì)胞遷移、肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化等[17-20]。早先有研究發(fā)現(xiàn)，m iRNA-375的下游靶基因包括14-4-3、SP1、ERK1/2等，而行使信號(hào)網(wǎng)絡(luò)樞紐的14-3-3信號(hào)蛋白可與TH蛋白相互作用并增強(qiáng)其活性，促進(jìn)腎上腺髓質(zhì)激素的合成[21-22]，但m iRNA-375在腎上腺的表達(dá)及作用目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

失重應(yīng)激狀態(tài)及適應(yīng)過(guò)程中腎上腺髓質(zhì)激素的合成、分泌和TH調(diào)節(jié)有待深入探討。隨著對(duì)m iRNA廣泛作用的認(rèn)識(shí)，結(jié)合我們前期實(shí)驗(yàn)研究中偶然發(fā)現(xiàn)m iRNA-375在腎上腺髓質(zhì)中存在的特殊表達(dá)情況，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)模擬失重條件下大鼠腎上腺髓質(zhì)中m iRNA-375的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)大鼠腎上腺髓質(zhì)m iRNA-375表達(dá)水平波動(dòng)明顯，表現(xiàn)為尾懸吊早期(6h)呈一過(guò)性顯著升高，隨后受到迅速而明顯抑制，在較低水平波動(dòng)，至實(shí)驗(yàn)第5d時(shí)表達(dá)量增加，7d時(shí)顯著升高，其變化趨勢(shì)與TH表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān)。結(jié)合文獻(xiàn)和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)腎上腺髓質(zhì)中m iRNA-375在基因水平上通過(guò)14-3-3信號(hào)蛋白調(diào)節(jié)(抑制)TH蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而影響腎上腺髓質(zhì)中腎上腺髓質(zhì)激素的合成和分泌，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

[1] Li ZP, Guo B, Li XO, et al. Changes in Cox-2 exp ression in gastric antrum m uscle layer, serum som atostatin and vasoactive intestinal pep tide levels in sim ulated weightlessness in rats[J].Med J Chin PLA, 2014, 39(5): 383-387. [李正鵬, 郭彪, 李曉鷗, 等. 模擬失重大鼠胃竇肌層Cox-2表達(dá)和血清SS及VIP水平的變化[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 39(5): 383-387.]

[2] Wang YC, Wu J, Sun QX, et al. Advances in research about effects of weightlessness or sim ulated weightlessness on cardiovascular system[J]. Acad J Chin PLA Med Sch, 2013, 34(1): 17-19. [王永春, 伍靜, 孫慶喜, 等. 失重或模擬失重對(duì)機(jī)體心血管系統(tǒng)影響的研究進(jìn)展[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2013, 34(1): 17-19.]

[3] Blaber E, Mar?al H, Burns BP. Bioastronautics: the influence of m icrogravity on astronaut health[J]. Astrobiology, 2010, 10(5):463-473.

[4] No rsk P. Blood p ressu re regu lation IV: adap tive responses to w eightlessness[J]. Eur J App l Physiol, 2014, 114(3): 481-497.

[5] Macho L, Koska J, Ksinantova L, et al. The response of endocrine system to stress loads during space flight in hum an sub ject[J].Ad v Space Res, 2003, 31(6): 1605-1610.

[6] Morey-Holten ER, Globus RK. The hind lim b un loading rodent m odel: technical aspects[J]. J App l Physio l, 2002, 92(4): 1367-1377.

[7] Wang CY, Wu JH, Song SJ, et al. Exp ression of hypoxia inducing factor-1α in rats' ovary under tail-suspension weightlessness[J].Med J Chin PLA, 2012, 37(9): 868-871. [王春雨, 吳繼華, 宋淑軍, 等. 尾懸吊模擬失重大鼠卵巢組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)變化[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 37(9): 868-871.]

[8] Leach CS, Ram baut PC. Endocrine responses in long-duration m anned space fligh t[J]. Acta Astronautica, 1975, 2(1-2): 115-127.

[9] Sam el A, Wegm ann HM, Velvoda M. Response of the circadian system to 6 deg rees head-dow n tilt bed rest[J]. Aviat Space Environ Med, 1993, 64(1): 50-54.

[10] Zhang GM, Liu KJ. The effect of head low bed (HDT-6) on the secrete rhythm icity of hum an urine catecho lam ine[J]. Space Med Med Eng, 1989, 2(2): 129-132. [張光明, 劉克嘉. 頭低位臥床(HDT-6b)對(duì)人尿兒茶酚胺分泌晝夜節(jié)律的影響[J]. 航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程, 1989, 2(2): 129-132.]

[11] Fan QC, Li YZ, Gao JY, et al. The regulation of space yangxin pill to sim u late cardiovascular system of sim ulated weightlessness rats[J]. Manned Space Fligh t, 2013, 19(1): 64-70. [范全春, 李勇枝, 高建義, 等. 太空養(yǎng)心丸對(duì)模擬失重大鼠心血管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用[J]. 載人航空, 2013, 19(1): 64-70.]

[12] Macho L, Kvetnansky R, Vigas M, et al. Effect of space flights on p lasm a horm one levels in m an and in experim ental anim al[J].Acta Astronau tica, 1991, 23:117-121.

[13] Chen J, Zhang LF, Ma J. A p re lim inary study on p lasm a catecholam ine responses in rats after 3-m onth tail-suspension[J].Chin J Aerosp Med, 1994, 5(1): 31-33. [陳杰, 張立藩, 馬進(jìn). 長(zhǎng)期尾部懸吊大鼠血漿兒茶酚胺反應(yīng)性的初步研究[J]. 中華航空醫(yī)學(xué)雜志, 1994, 5(1): 31-33.]

[14] Lelkes PI, Ram os EM, Chick DM, et al. M icrogravity decreases tyrosine hyd roxylase exp ression in rat ad renal[J]. FASEB J,1994, 8(14): 1177-1182.

[15] Poy MN, Eliasson L, Kru tzfeld t J, et al. A pancreatic isletspecific m icroRNA regulates insulin secretion[J]. Nature, 2004,432(11): 226-230.

[16] Yan JW, Lin JS, He XX. The Em erging ro le of m iR-375 in cancer[J]. In t J Cancer, 2014, 135(5): 1011-1108.

[17] Ling HY, Wen GB, Feng SD, et al. M icroRNA-375 p rom otes 3T3-L1 adipocyte differentiation through m odulation of extracellular signal-regu lated kinase signalling[J]. Clin Exp Pharm aco l Physio l, 2011, 38(4): 239-246.

[18] Abdelm ohsen K, Hutchison ER, Lee EK, et al. m iR-375 inhibits differentiation of neurites by lowering HuD levels[J]. Mo l Cell Bio l, 2010, 30(17): 4197-4210.

[19] Song J, Kim D, Chun CH, et al. M icroRNA-375, a new regulator of cadherin-7, supp resses the m ig ration of chond rogen ic p rogen ito rs[J]. Ce ll Signa l, 2013, 25(3): 698-706.

[20] Wang Y, Huang CQ, Reddy Chintagari N, et al. m iR-375 regulates rat alveo lar ep ithelial cell trans-differentiation by inhibiting Wn t/β-catenin pathw ay[J]. Nucleic Acids Res, 2013, 41(6):3833-3844.

[21] Roth D, Burgoyne RD. Stim ulation of catecholam ine secretion from ad renal ch rom affin cells by 14-3-3 p ro teins is due to reorganisation of the cortical actin netw ork[J]. FEBS Lett, 1995,374(1): 77-81.

[22] Skjevik AA, M ilen i M, Baum ann A, et al. The N-term ina l sequence of tyrosine hydroxylase is a con form ationally versatile m otif that binds 14-3-3 p roteinsand m em branes[J]. J Mol Biol,2014, 426(1): 150-168.