張艷紅，解 瑩，謝 晨，劉文芝，魏 越

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 感染疾病科，遼寧 大連116027;2.鞍山市中心醫(yī)院 傳染科，遼寧 鞍山114001)

丙型肝炎病毒(HCV)于1989年首次被分離出來(lái)，到目前已經(jīng)成為全球慢性肝臟疾病的主要原因之一［1］。據(jù)WHO 估計(jì)［2］，全球HCV 的感染率為3%，估計(jì)約1.7 億人感染，每年新發(fā)丙型肝炎約3.5萬(wàn)例。與其他肝炎病毒的預(yù)后不同，HCV 感染具有較高的慢性化比例，并與肝硬化和原發(fā)性肝癌的發(fā)生關(guān)系密切。根據(jù)HCV 基因的遺傳差異性，可將HCV 分為不同的基因型和亞型。根據(jù)HCV 基因型可以了解不同基因型和亞型的地理分布，有助于判定治療的難易程度及制定抗病毒治療的個(gè)體化方案。HCV 基因型與抗病毒治療和預(yù)后密切相關(guān)［3-4］。不同的基因?qū)α餍胁W(xué)、疫苗研制、臨床抗病毒治療、預(yù)后等方面有著明顯影響。本文采用型特異性引物逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR 法對(duì)189 例抗-HCV抗體和HCV RNA 均陽(yáng)性的患者進(jìn)行HCV 的基因分型，以了解鞍山地區(qū)HCV 流行的基因型分布狀態(tài)，為今后鞍山地區(qū)HCV 疫苗的研制及抗病毒治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo) 本

選取2011年4月至2014年5月期間鞍山市中心醫(yī)院門(mén)診及住院病例共189 例。所有患者的HCV抗體檢測(cè)和HCVRNA定量檢測(cè)均陽(yáng)性，并且所有患者出生地均在鞍山。所有標(biāo)本均于患者進(jìn)行抗病毒治療前收集，12 h 內(nèi)分離血清，-70 ℃冰存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器設(shè)備

PCR 儀5700 -PCR 為美國(guó)MJ 公司生產(chǎn)，低溫高速離心機(jī)日立55P-72 為日本Hitachi 公司生產(chǎn)，電泳儀為北京六一儀器廠生產(chǎn)。

1.3 主要試劑

HCV 抗體檢測(cè)為北京貝爾公司產(chǎn)品，HCV RNA檢測(cè)為瑞士羅氏公司產(chǎn)品，RNA 酶抑制劑為普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，Taq DNA 聚合酶為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品，限制性內(nèi)切酶Ⅲ為Biolabs 產(chǎn)品，瓊脂糖和相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等購(gòu)自北京華美生物技術(shù)有限公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)合成

引物根據(jù)HCV 病毒RNA 的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)區(qū)域選擇HCV RNA 5＇ -NCR 區(qū)。序列如下:

正向外引物F1:5＇—CTG TGA GGA ACT ACT GTC TT—3＇

反向外引物R1:5＇—AAC ACT ACT CGG CTA GCA GT—3＇

正向內(nèi)引物F2:5＇—TTC ACG CAG AAA GCG TCT AG—3＇

反向內(nèi)引物R2:5＇—GTT GAT CCA AGA AAG GAC CC—3＇

1.5 HCV RNA 基因分型檢測(cè)

1.5.1 血清HCV RNA 提取:1.5 mL 經(jīng)高壓滅菌的離心管，每管加血清100 μL，加入300 μL 的RNA 提取液:異硫氰酸胍(TRIZOL)，室溫靜置5 min;每管加入80 μL 氯仿，混勻后，室溫靜置10 min;在12000 r/min、4 ℃下離心15 min，吸取上清180 μL置入高壓滅菌的1.5 mL 離心管中，加入異丙醇200 μL;用75 ﹪的乙醇400 μL 洗滌RNA 沉淀1 次;在10000 r/min、4 ℃下離心8 min，棄上清，RNA 沉淀在空氣中自然干燥;加入DEPC 水(核酸酶抑制劑)10 μL，70 ℃水浴1 min 后立即冰浴備用。

1.5.2 分型PCR:逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR 擴(kuò)增(RTnested-PCR)RT 與第1 輪PCR 反應(yīng)在同一試管中進(jìn)行，取模板RNA 10 μL，5 ×緩沖液2 μL，dNTP 3 μL，引物F1 和R1 各0.5 μL，RNasin 0.15 μL，10 ×緩沖液2 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，加ddH2O 補(bǔ)充至20 μL;置5700 型全自動(dòng)PCR 儀上，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為42 ℃預(yù)變性20 min;依次30 個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)條件為93 ℃1 min，50 ℃30 s，72 ℃1.5 min，最后72 ℃延伸5 min，得到外擴(kuò)增PCR 產(chǎn)物。取5 μL 為模板，進(jìn)行第2 輪PCR 反應(yīng)，10 ×緩沖液2 μL，dNTP 2 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，引物F2 和R2 各0.5 μL，加ddH2O 補(bǔ)充至20 μL;置5700 型全自動(dòng)PCR儀上94 ℃預(yù)變性2 min 后，再依次30 個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)條件為94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃45 s，最后72 ℃延伸7 min，得到內(nèi)擴(kuò)增PCR 產(chǎn)物。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程均設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及空白對(duì)照。取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，加入制備好的含有0.5%溴化乙錠的2.0%瓊脂糖加樣孔中。于TBE 緩沖液中電泳20 min。然后在紫外線透照器下觀察橙紅色熒光帶。HCV 分型的PCR 產(chǎn)物為49 bp(1a)，144 bp(1b)，174 bp(2a)，123 bp(2b)。

2 結(jié) 果

189 份血清標(biāo)本，單基因型分別檢測(cè)出了1b 和2a 型，未發(fā)現(xiàn)混合型感染，其中11 份為陰性，1b 型95 例(53%)和2a 型83 例(47%)。電泳圖見(jiàn)圖1。

圖1 HCV 基因分型結(jié)果(2.0%瓊脂糖電泳)Fig 1 HCV genotype result (2.0% agarose electrophoresis)

3 討 論

根據(jù)HCV 基因組的序列同源性，Simmonds等［5］將HCV 分為6 種基因型和31 種亞型。在此分型方法的基礎(chǔ)上，目前已報(bào)道的基因型有11 個(gè)，基因亞型超過(guò)70 種［6］。本研究根據(jù)Simmonds 基因分型原理，采用型特異性引物逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR 法對(duì)189 例標(biāo)本進(jìn)行HCV 的基因分型。型特異性引物逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR 法簡(jiǎn)便易操作，但檢查一個(gè)樣本需使用多個(gè)引物，費(fèi)用較高。但是就臨床來(lái)說(shuō)，對(duì)于HCV 患者的診治是具有指導(dǎo)意義的，在臨床上常只需將1 型和其它基因型區(qū)別開(kāi)來(lái)，以決定抗病毒治療的療程和利巴韋林的劑量［7-8］。

HCV 基因型地理分布差異的流行病學(xué)特征，有助于明確病毒的種系發(fā)育和傳播途徑、有利于抗病毒治療和疫苗的研制。HCV 病毒分型具有一定的地域性，1 ～3 型呈全球流行，1a 型流行于歐洲、澳洲、南美洲和北美洲［9-12］;1b 和2a 型在亞洲地區(qū)分布廣泛;2 型也廣泛分布于歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家，但較1型少見(jiàn)［13］;基因3 型分布于東南亞國(guó)家［14］;基因4型主要存在非洲及中東地區(qū)，尤其是埃及，超過(guò)90%的病例感染［15］;基因5 型和6 型僅在局部地區(qū)流行，其中5 型僅在南非地區(qū)流行［16］，6 型是越南及其周邊地區(qū)的主要基因型［17］。中國(guó)多見(jiàn)1b 和2a型，以1b 為主［18］。中國(guó)南方，1b 型甚至可高達(dá)90%［19］;北方地區(qū)2a 分布高于南方［20］。本研究檢測(cè)了189 例HCV 分型結(jié)果顯示，1b 型95 例，占53%;2a 型83 例，占47%。與以前的報(bào)道不一致，可能與便捷的交通，導(dǎo)致其在國(guó)內(nèi)的傳播、人口的流動(dòng)、HCV 基因組變異有關(guān)［19，21-22］。近幾年一些研究顯示，中國(guó)北方地區(qū)基因型較單一，以1b 和2a 為主［23-24］，南方地區(qū)HCV 基因型種類(lèi)較多，以1b 為主，2a、3a、3b 及6a 型各自占較大比例［25-26］。本次檢測(cè)HCV 基因分型中，重要為1b 和2a 型，未發(fā)現(xiàn)其他基因型，與Chen YD 等［23］和白尚星［24］報(bào)道的相一致。由于本組收集的標(biāo)本數(shù)量有限及采用的型特異性引物逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR 法所選用的HCV 5＇-UTR 區(qū)高度保守，不同基因型在該區(qū)段的基因差異較小，不足以區(qū)分某些基因亞型;北方經(jīng)濟(jì)相對(duì)落后，研究HCV 基因分型的醫(yī)療機(jī)構(gòu)及報(bào)道也少。因此不能排除有其他基因型存在的可能。進(jìn)一步的結(jié)果有待與相關(guān)流行病調(diào)查機(jī)構(gòu)和醫(yī)院展開(kāi)科研合作，為HCV 所致肝炎的疾病控制和診斷治療提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上，本研究采用了型特異性引物逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR 法初步研究了鞍山地區(qū)的HCV 基因型的分布狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)鞍山地區(qū)HCV 分型為1b 型和2a 型兩種，有必要在臨床上推廣HCV 基因分型的常規(guī)檢測(cè)，以便更好了解中國(guó)北方地區(qū)HCV 基因型的分布及變化，為今后疫苗研制策略及抗病毒治療提供依據(jù)。

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