張曉春，金元哲

(中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院 心血管內(nèi)科，遼寧 沈陽110032)

Fractalkine(FKN)是一種近年發(fā)現(xiàn)的CX3C 家族趨化因子，具有趨化活性。IL -8 是一種炎癥因子，與動脈粥樣硬化關系密切。而關于FKN 與IL-8 的關系，目前國內(nèi)外研究較少。纈沙坦(Valsartan)已在臨床廣泛應用，除降壓作用外還表現(xiàn)出抑制炎癥反應的效應。本文主要研究FKN 對人血單個核細胞IL-8 表達的影響及蛋白激酶C(PKC)在其中的作用，并觀察纈沙坦的干預作用。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

健康人外周新鮮抗凝血、Hank’s 液(USA，康寧)、優(yōu)等胎牛血清(FBS)(Hyclone 公司)、青霉素及鏈霉素(華北制藥廠)、淋巴細胞分離液(濃度1.077 g/mL)(天津，TBD 公司)、乙二胺四乙酸(EDTA，Promega 公司)、人IL -8 ELISA 檢測試劑盒(武漢，USCN. Life Science Inc)、重組人Fractalkine(Sigma)、Ro31 -8220(Sigma)、Valsartan(Sigma)、RPMI1640 培養(yǎng)基(Gibco)，DMSO(Sigma)。

1.2 方 法

1.2.1 人外周血單個核細胞(PBMC)的分離及分組:無菌條件下，先用密度梯度離心法從人外周血濃縮白細胞中分離PBMC，然后每孔將1 ×106個單個核細胞/0.2 mL/鋪于96 孔細胞培養(yǎng)板中，將細胞隨機分為5 組，每組2 個復孔。對空白照組將PBMC置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。FKN 組在PBMC 培養(yǎng)液中加FKN，終濃度1 μg/mL。Ro31 -8220(PKC 阻斷劑)組在PBMC 培養(yǎng)液中加入Ro31 - 8220 (終 濃 度 為250 μg/mL)。FKN +Ro31 -8220 組在PBMC 培養(yǎng)液中加入Ro31 -8220(終濃度為250 μg/mL)，作用2 h 后，加入FKN(終濃度為1 μg/mL)。FKN +纈沙坦組在PBMC 培養(yǎng)液中加入纈沙坦(終濃度為250 μg/mL)，作用2 h后，加入FKN(終濃度為1 μg/mL)。除對照組外，另4 組FKN 終濃度加至1 μg/mL 后，均置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.2.2 IL -8 含量的檢測:收集各組單個核細胞的培養(yǎng)上清，在FKN 終濃度加至1 μg/mL 后于12 和24 h 用ELISA 法檢測其IL-8 表達。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結 果

細胞培養(yǎng)12 h 或24 h 后，單純Ro31 -8220 組與空白對照組比較，IL -8 表達無明顯差異(P ＞0.05)。FKN 刺激12 h 后，IL -8 表達較空白對照組均明顯減少(P ＜0.05);應用Ro31 -8220 預刺激2 h 后，再加入FKN 孵育12 h 組，IL-8 表達較FKN組明顯增加(P ＜0.05);應用纈沙坦預刺激2 h 后，再加入FKN 孵育12 h 組，IL-8 表達較FKN 組明顯減少(P ＜0. 05)。在細胞培養(yǎng)24 h 后，上述各組IL-8亦表現(xiàn)出同樣的變化。同時，細胞培養(yǎng)24 h各組IL-8 表達均較12 h 明顯減少(P ＜0.05)。

表1 各組細胞培養(yǎng)12 h 和24 h 后IL-8 濃度Tab 1 Results of the IL-8 expression from each group cultured after 12 h and 24 h (n=3，pg/mL，±s)

表1 各組細胞培養(yǎng)12 h 和24 h 后IL-8 濃度Tab 1 Results of the IL-8 expression from each group cultured after 12 h and 24 h (n=3，pg/mL，±s)

1)與空白對照組比較，P ＜0.05;2)與FKN 組比較，P ＜0.05

組別12 h 24 h空白對照組992.81±109.73 90.37±2.74 FKN 組 747.15±109.511) 74.41±4.601)Ro31-8220 組 976.42±88.522) 85.23±2.842)FKN+Ro31-8220 組 2218.08±184.121)2) 78.34±6.791)2 FKN+纈沙坦組 61.34±4.561)2) 57.47±1.331)2

3 討 論

最近研究表明，動脈粥樣硬化是一個炎癥反應過程［1-2］，F(xiàn)KN 是近年發(fā)現(xiàn)的一種特殊的炎癥趨化因子，具有趨化和粘附的雙重作用，與冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關［3-4］。IL -8 主要由單核巨噬細胞產(chǎn)生，通過趨化中性粒細胞引起炎癥反應，影響動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性，導致心血管事件的發(fā)生［5-6］。

PKC 是一種細胞質(zhì)酶，在未受刺激的細胞中，PKC 主要分布在細胞質(zhì)中，呈非活性構象。一旦有第二信使的存在，PKC 將成為膜結合的酶，它能激活細胞質(zhì)中的酶，參與生化反應的調(diào)控，同時也能作用于細胞核中的轉(zhuǎn)錄因子，參與基因表達的調(diào)控，是一種多功能的酶。研究表明，PKC 及其介導的信號通路與動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展密切相關［7］。

FKN 和IL -8 都可影響細胞內(nèi)炎癥因子的表達，但二者相互作用及引發(fā)的信號傳導機制尚不明確。本組此前研究表明，趨化因子FKN 可能通過ERK、PI3K 信號途徑抑制IL - 8 的表達，而通過NF-κB 途徑促進IL -8 的表達［8］。那么，PKC 信號途徑在FKN 抑制IL -8 表達中起著什么樣的作用?本實驗應用PKC 特異性抑制劑Ro31 -8220 阻斷PKC 的作用，結果顯示單純Ro31 -8220 對IL-8的表達無明顯影響，而經(jīng)FKN 誘導后IL -8 的表達明顯增加，說明FKN 可能通過PKC 途徑抑制IL -8的表達。

有研究顯示，纈沙坦(Valsartan)除降壓作用外還表現(xiàn)出抑制炎癥反應的效應［9］。根據(jù)本實驗結果，纈沙坦在FKN 抑制IL-8 表達過程中起協(xié)同抑制作用，機制可能是纈沙坦抑制炎癥因子的表達，從而進一步使IL-8 表達減少。

本研究證實FKN 可抑制人外周血單個核細胞IL-8 的表達，這一作用可能通過PKC 途徑實現(xiàn)，纈沙坦可增強FKN 對IL -8 表達的抑制作用。探索FKN 與IL-8 的關系，研究FKN 引發(fā)的信號傳導機制，有助于提高對免疫炎癥因子復雜的錯綜網(wǎng)絡關系的認識，指導臨床實踐;而Ang II 受體拮抗劑纈沙坦可抑制IL-8 的表達，為纈沙坦的抗動脈粥樣硬化作用提供了依據(jù)。

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