杜莉莉，呂潤瀟，于艷秋，辛 娜，金玉楠

(1.中國醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理生理教研室，遼寧 沈陽110013;2. 第二軍醫(yī)大學(xué)2008 級臨床醫(yī)學(xué)8年制，上海200433;3.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院 脊柱外科，上海200433)

巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞成分，具有抗感染、抗腫瘤和參與免疫應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能［1-2］。巨噬細(xì)胞來源于骨髓，廣泛分布于機(jī)體各種組織中，如肝、脾、骨髓、胸腺、胸腔、腹腔等。近年來關(guān)于巨噬細(xì)胞的研究越來越多，如何獲得數(shù)量充足、功能良好的巨噬細(xì)胞至關(guān)重要。小鼠價格便宜，其腹腔巨噬細(xì)胞多游離存在于腹水中易于獲得，因此，許多實驗室在進(jìn)行巨噬細(xì)胞研究時，往往選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為研究對象。建立一種高效分離小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的方法，是巨噬細(xì)胞研究工作者的首要任務(wù)。

現(xiàn)有的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分離方法有兩類，一類為先向腹腔注入刺激物，再通過腹腔灌洗及貼壁培養(yǎng)獲得巨噬細(xì)胞。另一類為不經(jīng)刺激直接腹腔灌洗并貼壁培養(yǎng)。但兩種方法均有不足之處，前者收集到的細(xì)胞與腹腔內(nèi)未經(jīng)抗原刺激原始狀態(tài)的巨噬細(xì)胞有很大差異，而后者獲得的巨噬細(xì)胞數(shù)量較少。

本實驗對現(xiàn)有方法加以改良，嘗試用一種新的簡便經(jīng)濟(jì)的方法分離小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。并將新方法提取的巨噬細(xì)胞與原有方法提取的巨噬細(xì)胞相比較，從獲得細(xì)胞數(shù)量，形態(tài)，遷移能力及分泌細(xì)胞因子能力等方面，篩選出一種更優(yōu)化的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分離方法，為巨噬細(xì)胞的體外研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與儀器

健康昆明小鼠，18 只，18 ～22 g，雌性，6 ～8 周。中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供。美國Thermo Fisher公司二氧化碳培養(yǎng)箱，日本Olympus 公司倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)，德國Sigma3K30 低溫高速離心機(jī)，蘇州凈化設(shè)備廠超凈工作臺。

1.2 試 劑

DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司，臺盼藍(lán)染料購自美國Sigma 公司，LPS 購自美國Sigma 公司，胎牛血清購自美國Gibco 公司，PE 標(biāo)記的抗小鼠CD14 購自美國BioLegend 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組:隨機(jī)將18 只小鼠分為3 組，每組6 只。5%淀粉肉湯組:5%淀粉肉湯，注射器注入小鼠腹腔，每次1 mL，每天1 次，注射3 d 后用5 mL 無血清DMEM 灌洗小鼠腹腔，重復(fù)灌洗1 次。無血清DMEM 組:直接用5 mL DMEM 液灌洗小鼠腹腔，重復(fù)灌洗1 次。75% 血清DMEM 組:將5 mL 75%DMEM 液注入小鼠腹腔，30 min 后回收液體并用5 mL 無血清DMEM 灌洗小鼠腹腔。

1.3.2 5%淀粉肉湯制備:蒸餾水100 mL，牛肉膏0.3 g，蛋白胨1.0 g，氯化鈉0.5 g，可溶性淀粉5 g，加熱助溶，煮沸滅菌，4 ℃保存。

1.3.3 小鼠腹腔灌洗:頸椎脫臼法處死小鼠，浸入75%酒精溶液5 min。取出小鼠，置于無菌操凈臺上，仰臥位固定小鼠，無菌條件下將小鼠皮膚剪一小口，眼科鑷子提起該處皮膚，雙手將皮膚沿著開口向上撕開，暴露腹膜，此時腹膜應(yīng)完整，向腹腔內(nèi)注入預(yù)冷的無血清DMEM 5 mL，輕柔小鼠腹部5 min后，用吸管反復(fù)沖洗腹膜腔后，回收灌洗液。

1.3.4 貼壁純化培養(yǎng)巨噬細(xì)胞:將回收的灌洗液注入干凈的離心管中，1000 r/min 離心10 min，連續(xù)2次，棄上清液。細(xì)胞沉淀經(jīng)DMEM 培養(yǎng)液洗滌后，用10%血清DMEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞懸液接種于6 cm 培養(yǎng)皿，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，2 h 后，棄培養(yǎng)上清，用10%血清DMEM 培養(yǎng)液輕輕沖洗培養(yǎng)皿1 ～2 次，棄去未貼壁的細(xì)胞，獲得的貼壁細(xì)胞即為巨噬細(xì)胞。

1.3.5 巨噬細(xì)胞形態(tài)觀察:細(xì)胞培養(yǎng)后每日用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.6 巨噬細(xì)胞純度檢測:細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，用0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×106/mL，1000 r/min，離心5 min 棄上清。100 μL PBS 重懸細(xì)胞，再加入PBS 稀釋的50 μL PE 標(biāo)記的抗小鼠CD14 ，避光作用30 min，1000 r/min，離心5 min，棄上清液后，PBS 洗2 次，然后加入200 μL PBS 吹打混勻細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD14 表達(dá)水平。每組檢測重復(fù)3 次。

1.3.7 巨噬細(xì)胞數(shù)量及存活率檢測:細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用0.25%胰酶消化，計數(shù)。統(tǒng)計每只小鼠腹腔中分離的巨噬細(xì)胞數(shù)。取細(xì)胞懸液0.5 mL，滴加等量0.4%臺盼藍(lán)染液置于Eppendorf 管中，混勻，取1滴染色細(xì)胞懸液加入細(xì)胞計數(shù)板中，顯微鏡下計數(shù)。

1.3.8 巨噬細(xì)胞遷移能力檢測:用marker 筆在24孔培養(yǎng)板背側(cè)劃線，0.5 ～1 cm 一道，劃線橫穿孔，用0.25%胰酶消化巨噬細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度后接種于24 孔板，5 ×104個/孔，每組3 個復(fù)孔，過夜。第2天用200 μL 槍頭垂直劃痕，PBS 洗3 次后換10%血清DMEM 培養(yǎng)液，置于37 ℃，5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱6 h、12 h 后顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移距離。將巨噬細(xì)胞不同時間點的遷移距離與0 h 劃痕距離相比，計算巨噬細(xì)胞遷移指數(shù)。

1.3.9 LPS 刺激巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力檢測:用0.25%胰酶消化巨噬細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度2 ×105個/mL，取100 uL 細(xì)胞懸液接種于96 孔板，放入37℃，5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱，細(xì)胞貼壁后，每孔加入50 μL LPS(1 μg/mL)，3 h 或6 h 后收集細(xì)胞上清，ELISA 檢測TNFα 和IL-1β(3 h)。ELISA 檢測IL-6(6 h)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件處理，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P ＜0.05 為差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 巨噬細(xì)胞形態(tài)觀察

不同分離方法提取的巨噬細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24 h 后顯微鏡下觀察，各組細(xì)胞形態(tài)相似，均呈圓形，橢圓形，梭形等。體積大，胞漿豐富，少量有偽足，見圖1。

圖1 巨噬細(xì)胞形態(tài)觀察(×100)Fig 1 Observation of the morphology of macrophage(×100)

2.2 巨噬細(xì)胞純度檢測

流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞CD14 的表達(dá)情況，5%淀粉肉湯組為(82.40 ±2.45)%，無血清DMEM組為(84. 41 ± 1. 18)%，75% 血清DMEM 組為(81.32 ±2.73)%，各組間比較差異無顯著性意義，P ＞0.05。見圖2。

圖2 巨噬細(xì)胞細(xì)胞CD14 表達(dá)情況Fig 2 The expression of CD14 of macrophage

2.3 巨噬細(xì)胞數(shù)量及存活率檢測

75%血清DMEM 組分離出的巨噬細(xì)胞數(shù)量，與其他兩組比較差異有顯著性意義，P ＜0.05。5%淀粉肉湯組分離的巨噬細(xì)胞數(shù)量多于無血清DMEM組，差異有顯著性意義，P ＜0.05。3 組的巨噬細(xì)胞存活率比較，差異無顯著性意義，P ＞0.05。見表1。

2.4 巨噬細(xì)胞遷移能力檢測

劃痕實驗6 h 后，75%血清DMEM 組巨噬細(xì)胞遷移距離遠(yuǎn)，遷移指數(shù)明顯高于其他兩組，差異有顯著性意義，P ＜0.05。劃痕實驗12 h后，75%血清DMEM 組劃痕各區(qū)域均有巨噬細(xì)胞，遷移指數(shù)高于其他兩組，差異有顯著性意義，P ＜0.05。與無血清DMEM 組相比，5%淀粉肉湯組巨噬細(xì)胞遷移距離遠(yuǎn)，遷移指數(shù)高，差異有顯著性意義，P ＜0.05。見圖3、表2。

表1 巨噬細(xì)胞數(shù)量及存活率Tab 1 The number and survival rate of macrophage

圖3 巨噬細(xì)胞遷移(×100)Fig 3 The migration of macrophage(×100)

表2 巨噬細(xì)胞遷移指數(shù)Tab 2 Migration index of macrophage

2.5 LPS 刺激巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力檢測

75%血清DMEM 組分離的巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS 刺激后，分泌TNFα，IL -1β，IL -6 明顯多于其他兩組，差異有顯著性意義，P ＜0.05。無血清DMEM 組與5%淀粉肉湯組中巨噬細(xì)胞分泌的TNFα，IL -6差異均無顯著性意義，P ＞0.05。無血清DMEM 組中巨噬細(xì)胞分泌IL-1β 多于5%淀粉肉湯組，差異有顯著性意義，P ＜0.05。見表3。

表3 LPS 刺激巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力檢測Tab 3 The cytokines secretion ability of macrophage stimulated by LPS

3 討 論

巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，在機(jī)體內(nèi)可抗感染、抗腫瘤、參與免疫應(yīng)答及免疫調(diào)節(jié)，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對象。

近年來有關(guān)巨噬細(xì)胞的研究越來越受到人們的關(guān)注。巨噬細(xì)胞的提取是體外研究巨噬細(xì)胞的前提。隨著體外分離培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，提取方法越來越多，提取的部位也不盡相同，如肺血管巨噬細(xì)胞、腎小球巨噬細(xì)胞，骨髓基質(zhì)巨噬細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞等。小鼠來源容易，價格便宜，腹腔腹水中有很多巨噬細(xì)胞存在，因此，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞成為很好的巨噬細(xì)胞來源。

從文獻(xiàn)可知，現(xiàn)有的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分離方法大致相似，灌洗腹腔后吸出含巨噬細(xì)胞的灌洗液，利用巨噬細(xì)胞貼壁生長的特點將其分離。但每種方法也各有差異。有研究者先注入腹腔巨噬細(xì)胞刺激劑(如淀粉肉湯、LPS 等)，吸引大量的巨噬細(xì)胞進(jìn)入腹腔后再用灌洗液灌洗［3］。也有報道直接應(yīng)用灌洗液灌洗小鼠腹腔分離巨噬細(xì)胞［4］。前者雖能收集到大量的巨噬細(xì)胞，但由于經(jīng)過刺激，所獲得的巨噬細(xì)胞與體內(nèi)原始狀態(tài)的巨噬細(xì)胞差異較大，不適合做功能方面的研究。而直接灌洗所獲得的細(xì)胞雖然細(xì)胞狀態(tài)較好，但是數(shù)量有限。本實驗采用一種新的方法分離小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，即將預(yù)冷的含75%血清的DMEM 液注入小鼠腹腔，按摩30 min 后回收液體并用無血清DMEM 灌洗，貼壁培養(yǎng)分離出其中的巨噬細(xì)胞。將此方法獲得的巨噬細(xì)胞與其他方法分離的巨噬細(xì)胞相比較，結(jié)果表明，不同方法分離的巨噬細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)及存活率等方面無明顯差異。流式細(xì)胞儀檢測巨噬細(xì)胞特異性表面標(biāo)記CD14［5-6］，結(jié)果表明各組細(xì)胞CD14 的陽性率無明顯差異，即所提取巨噬細(xì)胞的純度無差異。但新方法獲得的巨噬細(xì)胞數(shù)量最多，且細(xì)胞遷移能力及分泌TNFα、IL-1β 及IL -6 的能力明顯增強(qiáng)。炎癥發(fā)生時，巨噬細(xì)胞遷移至炎癥局部并釋放炎癥因子，TNFα、IL-1β 及IL -6 在激活細(xì)胞因子級聯(lián)、趨化炎性細(xì)胞［7-8］、催化炎癥反應(yīng)進(jìn)程［9-10］等方面均起到了重要作用。由于新方法提取巨噬細(xì)胞的遷移能力及分泌炎癥因子的能力明顯增強(qiáng)，因此更有利于體外對其功能的研究。

本實驗所用新方法提取的巨噬細(xì)胞在數(shù)量及功能上都具有優(yōu)勢，該方法在操作時應(yīng)注意以下幾個關(guān)鍵點:(1)小鼠處死前一天應(yīng)空腹，饑餓至少8 h。(2)剪開小鼠腹部皮膚時，可先在下腹部剪一小口，再用手向上將皮膚撕開，這樣既能充分暴露腹膜，也能保證腹膜的完整，減少污染的機(jī)會。(3)腹腔注入的75% 血清DMEM 液提前4 ℃預(yù)冷效果好。(4)向腹腔注入灌洗液時，應(yīng)先用小鑷子將腹膜提起，在腹膜與腸道的空隙處橫向進(jìn)針，防止刺破腸道出血，避免提取細(xì)胞中混入紅細(xì)胞。(5)回吸灌洗液時，注射器針頭容易被腸系膜堵塞，可無菌條件下打開腹腔，利用無針頭的注射器，在腹腔最低處回吸灌洗液，這樣既可避免針眼被堵塞，也可迅速而又接近完全地回吸灌洗液。關(guān)于75%血清DMEM液促進(jìn)巨噬細(xì)胞向腹腔內(nèi)聚集的機(jī)制，本實驗并未涉及，需要在以后的實驗中進(jìn)一步探討。

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