郭淑娟，王琮民

(1.邯鄲市中心醫(yī)院 老年病科，河北 邯鄲056001;2.河北工程大學附屬醫(yī)院 神經(jīng)內科，河北 邯鄲056001)

腦卒中一般分為缺血性和出血性兩種，缺血性腦卒中約占75%，是致殘和致死率高、治療難的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。其發(fā)病機制一般認為是由于缺血缺氧誘發(fā)的興奮氨基酸毒性的釋放和細胞內鈣超載，使肌體清除氧自由基(ROS)能力下降，氧自由基大量增加最終導致氧化應激損傷［1］。因此，及早阻斷或清除多余的ROS 可以減輕缺血后腦損傷。

普拉克索(PPX)分S-PPX 和R+PPX 兩種異構體，兩者都有抑制ROS 產(chǎn)生的作用，屬于線粒體靶向抗氧化劑，前者是治療帕金森病的常用藥，后者和多巴胺D2/D3 受體親和性極低，一般不會產(chǎn)生多巴胺能不良反應［2］。已有報道指出，R+PPX 可抑制肌萎縮側索硬化(ALS)的發(fā)展［3］，但其對缺血腦卒中損傷的研究鮮有報道。本實驗利用線栓法制作中動脈栓塞(MCAO)模型，通過腹腔注射R+PPX，觀察其在不同時間對各組腦梗死體積變化及大鼠腦中ROS 數(shù)量影響，為臨床治療缺血腦卒中提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗儀器及試劑:大鼠呼吸機(美國CWE公司)、DGD-300S 電腦雙極電凝器(功率自動補償型，銘志誠醫(yī)療公司)、TDA -8301H 溫度顯示調節(jié)儀、透射電鏡(Olympus 公司)、BH-2 顯微鏡(日本Phillip 公司)、TTC(上海恒遠生物科技有限公司)、R+PPX(天津大學科威公司)、新型熒光探針H2DCF-DA(Sigma 公司)。

1.1.2 實驗動物分組及模型制備:成年雄性健康大鼠60 只，體重250 ～300 g，購于天津市實驗動物研究所，清潔級，并在河北工程大學醫(yī)學院動物實驗室進行實驗。實驗室設備齊全，實驗條件良好。采用抽簽方法將60 只健康雄性大鼠均分為3 組:假手術(sham)組，中動脈栓塞(MCAO)組和R +PPX 注射中動脈栓塞(R +PPX +MCAO)組，每組20 只。再灌注分為兩個時間點，8 h 和24 h，每次10 只。R+PPX+MCAO 組于MCAO 前30 min 腹腔注射R+PPX(1 mg/kg)，sham 和MCAO 組注射等量的生理鹽水。

大鼠用10%水合氯醛過量麻醉，仰臥固定，頸部正中切口，逐層分離左側頸總動脈(CCA)，頸內動脈(ICA)，頸外動脈(ECA)。用動脈夾夾閉左側CCA 和ICA，在ECA 上剪一小口，注入肝素鈉生理鹽水，將準備好的尼龍栓線插入ECA，用手術線輕輕結扎，松開ICA 的動脈夾，尼龍線順勢插入ICA，至ICA 和ECA 交叉處，然后調整插入栓線角度，要保證栓線的頭部進入ICA，然后緩慢向ICA 入顱方向移動栓線約18 mm 至大腦前動脈起始處，阻斷大腦中動脈血液供應，MCAO 建模成功，記錄MCAO時間，將栓線扎緊，移去CCA 動脈夾，并且縫合各層的皮膚組織，栓線應在切口外留2 cm，MCAO 2 h時，將栓線輕輕拉出，線栓頭端退回ECA 處，再灌注完成。手術完畢可用慶大霉素注射液沖洗傷口，手術過程規(guī)范、無菌，此過程大鼠體溫保持在(37 ±0.5)℃，心率和動脈壓保持在正常范圍內。

1.2 方 法

1.2.1 腦梗死體積計算［4］:缺血再灌注8 h 或24 h大鼠用水合氯醛(10%)過量麻醉，斷頭取腦，在-24 ℃冰箱中冷凍全腦30 min，從額極至枕極把大腦切成2 mm 厚度的冠狀切片5 個層面，將切片置于2%TTC 染色液中，在37 ℃條件下，避光孵育20 min，將5 個切片順序擺放在藍色背景平板上，拍照，計算腦梗死體積百分比。腦梗死體積百分比=梗死體積÷全腦體積×100%。

1.2.2 H2DCF-DA 染色分析［5］:將TTC 染色后制作的腦組織冷凍切片各取第4 片連續(xù)冷凍再切片，切為20 μm 10 片，利用H2DCF -DA 進行染色，檢測ROS 陽性表達，用專業(yè)圖像分析軟件NIS Element確定半暗帶區(qū)H2DCF-DA 陽性細胞數(shù)和平均熒光強度，熒光強度平均值=總熒光強度值/H2DCF -DA 陽性細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 3 組大鼠MCAO 建模過程的生理指標檢測值

建立大鼠中動脈栓塞模型過程中，3 組大鼠的心率、動脈壓和肛溫差異經(jīng)單因素方差分析差異無顯著性意義(P ＞0.05)，可以忽略手術對實驗動物的影響。見表1。

表1 3 組大鼠在MCAO 建模過程的生理指標檢測值Tab 1 The physiological parameters of three groups at different time (±s)

表1 3 組大鼠在MCAO 建模過程的生理指標檢測值Tab 1 The physiological parameters of three groups at different time (±s)

組別 心率(次/min) 動脈壓(mmHg) 肛溫(℃)sham 組340.73 ±10.07 99.76 ±10.53 37.09 ±0.33 MCAO 組 345.04 ±9.45 99.34 ±9.96 36.85 ±0.53 R+PPX+MCAO 組342.72 ±11.31 98.93 ±10.02 36.95 ±0.34

2.2 3 組大鼠腦梗死體積比較

再灌注后8 h 和24 h，MCAO、R +PPX +MCAO兩組與sham 組相比較，梗死體積明顯增大(P ＜0.05)，再灌注后8 h，R +PPX +MCAO 組的梗死體積明顯小于MCAO 組(P ＜0.05)，再灌注后24 h，MCAO、R+PPX +MCAO 兩組的腦梗死體積無明顯差異(P ＞0.05)，且MCAO、R +PPX +MCAO 兩組的腦梗死體積均隨時間的延長而增加。見表2。不同時間腦梗死情況見圖1。

表2 3 組大鼠在不同時間腦梗死體積百分比Tab 2 The infract volume of three groups at different time(%)

圖1 不同時間腦梗死體積Fig 1 The infract volume at different time

2.3 H2DCF-DA 監(jiān)測大鼠腦內ROS 陽性細胞數(shù)目和熒光染色結果分析

熒光染色sham 組大鼠沒有出現(xiàn)腦梗死，圖像顯示未出現(xiàn)缺血半暗帶，無H2DCF - DA 染色。MCAO、R+PPX +MCAO 兩組在兩個時間點的半暗帶區(qū)均出現(xiàn)H2DCF -DA 染色細胞，BH -2 顯微鏡下胞體為綠色，可清晰看到凸起，再灌注8 h 時，H2DCF-DA 染色細胞R +PPX +MCAO 組明顯低于MCAO 組(P ＜0.05)，熒光色也較弱，但24 h 時，兩組的H2DCF -DA 染色細胞數(shù)、熒光強度無明顯差異(P ＞0.05)。見圖2，表3、4。

表3 3 組大鼠在不同時間ROS 陽性細胞數(shù)Tab 3 ROS(+)cell numbers of three groups

表4 3 組大鼠在不同時間熒光強度Tab 4 Fluorescence intensity of three groups

3 討 論

腦卒中時，體內會產(chǎn)生一些可以清除自由基的酶，這些酶可以對腦缺血損傷起到保護作用［6］。故增加體內的抗氧化劑可以抑制ROS 的產(chǎn)生從而保護腦組織。R(+)普拉克索(R +PPX)是普拉克索兩種異構體其中之一，具有抗氧化作用，可以抑制線粒體ROS 的產(chǎn)生，而且與多巴胺D2/D3 受體具有較低的親和性，可以避免體內的多巴胺能不良反應。已有報道指出，R+PPX 可以抑制肌萎縮側索硬化，可使肌萎縮側索硬化大鼠模型的生命延長［7］。R +PPX 容易突破血腦脊液屏障，其在腦中的濃度比其在血漿中的濃度高出5 倍［8］。本實驗采用建模前30 min 給大鼠腹腔注射R +PPX 的方法觀察其效果，實驗數(shù)據(jù)表明，缺血再灌注8 h 時，R+PPX 干預組的腦梗死體積明顯小于未干預組，血再灌注24 h時，R+PPX 干預組的腦梗死體積和未干預組的腦梗死體積差異不大，說明一次性注射R +PPX 對腦缺血損傷有保護作用，但保護作用持續(xù)時間短。

圖2 不同時間熒光染色結果Fig 2 H2DCF-DA fluorescence staining results at different time

本實驗采用H2DCF -DA 熒光法測定ROS，用專業(yè)圖像分析軟件NIS Element 確定半暗帶區(qū)H2DCF-DA 陽性細胞數(shù)和平均熒光強度，實驗數(shù)據(jù)表明，缺血再灌注8 h 時，R + PPX 干預組的H2DCF-DA 陽性細胞數(shù)和平均熒光強度明顯低于未干預組，說明R +PPX 可以抑制腦缺血后腦組織內ROS 的生成，且ROS 和腦梗死體積降低的時間點同步，這一結果提示R + PPX 可能是通過清除ROS 而起到對缺血腦組織的保護作用的。再灌注24 h 時，R+PPX 干預組和未干預組的H2DCF-DA陽性細胞數(shù)和平均熒光強度差異不大，說明R +PPX 清除ROS 的時效性不強，這可能與用藥的劑量、頻率有關系，故以后可以觀察不同劑量和多次用藥時R+PPX 對缺血腦損傷的保護作用。

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