解繼平，張 岷，方 紅，趙子偉，萬 毅，姚永強

(大連大學附屬中山醫(yī)院 乳腺甲狀腺外科，遼寧 大連116000)

據統(tǒng)計，乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，全球范圍內乳腺癌患者的發(fā)生率和死亡數量逐年升高［1］。乳腺癌遠處復發(fā)、轉移，是該病最主要的致死原因，惡性腫瘤細胞進入血液循環(huán)，并在遠處器官組織粘附、定植、形成微轉移灶是其中的關鍵環(huán)節(jié)［2］。

循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)檢測技術是一種新興的惡性腫瘤檢查方法，通過采取患者的外周血便可實現對血液循環(huán)中由病變部位脫落的惡性腫瘤細胞進行篩查、計數。在臨床上，目前CTC 檢測主要應用于預后評價、療效評估、病理活檢及指導個體化治療。

作為當前的研究熱點，越來越多的研究報道了CTC 與乳腺癌不同分期、分型、發(fā)病年齡、免疫組化特點的相關性［3］，但不同轉移灶晚期乳腺癌患者CTC 檢測結果的差異鮮有相關報道。本研究通過分析CTC 在不同轉移灶晚期乳腺癌患者中的檢出率及陽性率，評價不同復發(fā)部位乳腺癌對CTC 檢測的敏感性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 病例及分組:收集119 例2014年9月至2015年4月于大連大學附屬中山醫(yī)院住院的復發(fā)轉移晚期乳腺癌患者的臨床資料，年齡49 ～70 歲(中位年齡59.5 歲)，女性。入組患者均曾接受手術治療及術后輔助化療(AC -T 或者TC 方案)，術后復發(fā)時間4 ～11年，平均7.8年，經影像學檢查或組織細胞學病理明確有且僅有單器官(肝、骨、肺)轉移灶，分別記為肺轉移組、肝轉移組及骨轉移組。其中肝轉移組31 例，肺轉移組40 例，骨轉移組48例。

1.1.2 儀器與器材:cellsearch 系統(tǒng)(強生公司;該系統(tǒng)已通過美國FDA 批準，是目前國際認可的應用于乳腺癌循環(huán)腫瘤細胞檢測的有效方法)，本院中心實驗室提供;cellsave 儲存管(北京佰樂良成科技有限公司);細胞分選免疫磁珠(天津灝洋生物制品有限公司)，鼠抗人細胞角蛋白單克隆抗體(美國CST 公司)。

1.1.3 標本采集:所有確診復發(fā)轉移的患者均于接受治療前空腹抽取外周血7.5 mL 置于cellsave 儲存管并立刻送檢。

1.2 循環(huán)腫瘤細胞檢測方法

7.5 mL 血樣中加6.5 mL 緩沖液稀釋，4000 r/min 離心20 min。吸出上清液，加入可與上皮細胞特異性結合的免疫磁珠，接入磁場進行磁孵育15 min，吸出液體和未結合的磁珠顆粒，加入鼠抗人細胞角蛋白單克隆抗體進行染色標記。將所得的染色細胞放入MagNet 樣本盒中進行捕獲，最后人工完成CTC細胞的判讀、計數。

CTC 判讀標準:對富集的細胞進行染色處理，空白對照組作為陰性的比色標準，白細胞抗原CD45熒光抗體用于排除白細胞的干擾，檢出CD45 陰性且腫瘤特異性細胞核抗原DAPI、細胞質抗原CK 均為陽性的細胞，判定為CTC［4］。

1.3 結果判斷標準

以7.5 mL 血中檢測出的CTC 個數為單位，分別定為未檢出(CTC 0 個)，檢出(CTC≥1 個)和陽性(CTC≥5 個)［4］，并以此計算CTC 的檢出率及陽性率。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS17.0 分析軟件進行統(tǒng)計學處理，臨床資料的描述采用百分比，頻數資料組間分析采用χ2檢驗，取P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 CTC 熒光圖像

根據前文所述的判讀標準，轉移患者血清細胞中，CD45 陰性，DAPI 與CK 均為陽性，且兩者整合后熒光染色區(qū)域示細胞形態(tài)完整的，即為CTC。見圖1。

圖1 不同轉移部乳腺癌位患者血清CTC 熒光圖片Fig 1 CTC fluorescence images of advanced breast cancer patients with different metastases

2.2 CTC 檢出率

不同轉移部位乳腺癌患者與CTC 檢出率的相關性不同，肝轉移組外周血中35.5%(11/31)可檢出循環(huán)腫瘤細胞，肺轉移組外周血中47.5%(19/40)可檢出循環(huán)腫瘤細胞，骨轉移組為68.8%(33/48)，骨轉移組明顯高于肺及肝轉移組(P ＜0.05)。肝轉移組與肺轉移組比較差異無顯著性意義(P ＞0.05)。見表1。

2.3 CTC 陽性率

不同組別的CTC 陽性率不同，其中肝轉移組外周血中循環(huán)腫瘤細胞陽性率為32.3%(10/31)，肺轉移組為12. 5%(5/40)，骨轉移組為12. 5% (6/48)。其中肝轉移組的陽性率最高，與肺及骨轉移組比較有明顯差異(P ＜0.05)。骨轉移組與肺轉移組間比較差異無顯著性意義(P ＞0.05)。見表1。

表1 乳腺癌不同轉移部位患者的CTC 檢出率及陽性率Tab 1 CTC detection in patients of advanced breast cancer with different metastases n(%)

3 討 論

目前臨床上針對不同乳腺癌患者制定的一系列包括手術，輔助化療，放射治療，基因靶向，內分泌治療在內的綜合及個體化治療方案［5］，使乳腺癌成為發(fā)病率雖高，但預后相對較好的惡性腫瘤。乳腺癌復發(fā)轉移是影響其預后最重要的因素。根據腫瘤的病理分型，分期，淋巴結轉移情況，免疫組化特點等，可對其遠期復發(fā)轉移風險做大體的評估［6］，但缺少對患者病情的實時監(jiān)測。通過定期隨診，做腫瘤標記物檢測及影像學檢查，可了解患者的病情進展，但很難早期發(fā)現微小轉移灶且對長期預后沒有預測作用。循環(huán)腫瘤細胞(CTC)檢測克服了以上傳統(tǒng)診療方法的不足。檢測外周血液中的惡性腫瘤細胞，不但可實時把握患者循環(huán)系統(tǒng)中隱藏的癌負荷，早期推測其腫瘤存在血行轉移的可能性［7］，還能通過血液中CTC 的計數，對患者的遠期預后進行評價。2004年由Cristofanilli 等［8］進行的多中心、前瞻性研究表明，在晚期乳腺癌患者中，每7.5 mL 血CTC≥5個的患者無進展生存期(Progression -free survival，PFS)及總生存期(overall survival，OS)均明顯短于CTC ＜5 個的患者。此研究結果目前已成為共識，臨床上把晚期復發(fā)轉移乳腺癌患者的CTC 檢測結果≥5 個定為陽性，提示患者預后相對較差。此外，根據比較治療前后患者CTC 變化，可對此種治療方法的療效進行評價［9］。

本研究在前期預實驗中，共選取20 例經術后病理確診為乳腺纖維腺瘤的患者進行CTC 檢測，僅在1 例患者的血液標本中檢出了1 個CTC，檢出率5%，陽性率0%，符合國內外文獻報道的正常人CTC 檢測結果［10］，可排除因檢測技術水平導致假檢出率、假陽性率所致的結果偏移。

分析本研究結果可知，在不同轉移灶晚期乳腺癌患者中，骨轉移患者的CTC 檢出率明顯高于其他兩組，肺及肝轉移組的檢出率無明顯差別?？赡芴崾竟寝D移時，患者外周循環(huán)血中存在惡性腫瘤細胞的機率相對較大，亦或現今采用cellsearch 系統(tǒng)的CTC 檢測方法，對于乳腺癌骨轉移的敏感性較高，或許更應推薦此類患者進行該項檢測。CTC 檢測的陽性率分析，則是肝轉移組的明顯高于肺及骨轉移組，表明乳腺癌發(fā)生肝轉移的預后可能較其他器官單發(fā)轉移差，此外肝轉移患者CTC 檢測結果陽性率較高，其在接受治療前后CTC 計數的變化可能較為明顯，所以CTC 檢測可能更適用于肝轉移患者的療效評價。

綜上所述，本結果顯示了不同轉移灶晚期乳腺癌患者外周血CTC 檢測的敏感性及陽性率，希望對晚期乳腺癌的臨床治療有啟示及指導作用。由于本研究的入組樣本量有限，且CTC 的檢測技術和陽性標準尚無統(tǒng)一的國際規(guī)范，本結果有待于繼續(xù)進行大樣本量研究，多中心實驗來進一步驗證。

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