杜莉莉，呂潤(rùn)瀟，楊曉漪，辛 娜，馬廷賢

(1. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng)110013;2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院 研究生隊(duì)，上海200433;3. 第二軍醫(yī)大學(xué) 研究生隊(duì)，上海200433;4. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)95 期臨床醫(yī)學(xué)7年制，遼寧 沈陽(yáng)110013)

氧是生物生存的必要條件，大部分組織細(xì)胞需要氧來(lái)產(chǎn)生足夠的ATP 以供細(xì)胞代謝。目前，體外細(xì)胞的培養(yǎng)通常是在體積分?jǐn)?shù)為21%的常氧中進(jìn)行的，但事實(shí)上，正常機(jī)體平均氧濃度僅為5%［1］，而且人體各組織器官的氧濃度也存在較大差異，血液中氧濃度為10% ～13%［2］，軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境的氧濃度為1% ～7%［3-4］，腦組織氧濃度為3% ～14%，肺泡血管氧濃度為14%。有研究者嘗試了細(xì)胞體外低氧培養(yǎng)，低氧培養(yǎng)更接近體內(nèi)的生理環(huán)境。雖然有文獻(xiàn)將接近體內(nèi)的低氧水平稱為缺氧，但實(shí)際上缺氧只是相對(duì)于常氧培養(yǎng)而言的。低氧培養(yǎng)更符合細(xì)胞的生理特性，也更有利于觀察細(xì)胞在體內(nèi)的改變。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是成體多功能干細(xì)胞，可從骨髓、血液等成人組織中分離得到，具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能，誘導(dǎo)后可分化為脂肪細(xì)胞，成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞等。MSCs 可遷移至損傷組織促進(jìn)組織修復(fù)，在再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域獲廣泛關(guān)注。胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(placental mesenchymal stem cells，pMSCs)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的MSCs，其來(lái)源廣泛、取材簡(jiǎn)便、對(duì)供體無(wú)害、無(wú)倫理限制，對(duì)許多疾病有一定的治療作用，是很好的MSCs 來(lái)源［5-6］。有研究表明低氧可促進(jìn)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖及遷移，而pMSCs 在低氧培養(yǎng)時(shí)的生物學(xué)特性目前并不十分清楚。

本實(shí)驗(yàn)嘗試從人胎盤中提取間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行鑒定，并將細(xì)胞在體積分?jǐn)?shù)為21%O2、5%O2、3%O2、1%O2和0.5%O2的條件下培養(yǎng)，觀察不同氧濃度對(duì)pMSCs 的形態(tài)、增殖、遷移及VEGF 分泌表達(dá)量的影響，為研究氧濃度對(duì)pMSCs 生物學(xué)特性的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

缺氧培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher 公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher 公司);醫(yī)用凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠);低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司);胎牛血清(美國(guó)Gibco 公司);DMEM 培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco 公司);非必需氨基酸(美國(guó)Gibco 公司);L-谷氨酰胺(美國(guó)Gibco 公司);青鏈霉素(美國(guó)Gibco 公司);β -巰基乙醇(美國(guó)Gibco 公司);0.25%Trypsin-EDTA(美國(guó)Gibco 公司);鼠抗人直標(biāo)單克隆抗體(美國(guó)BD 公司);ELISA 試劑盒(美國(guó)sigma 公司)。

胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞:經(jīng)產(chǎn)婦同意和倫理委員會(huì)認(rèn)證后，無(wú)菌條件下取剖宮產(chǎn)的足月健康新生兒胎盤組織(來(lái)源于沈陽(yáng)市和平區(qū)婦幼醫(yī)院)。

1.2 pMSCs 的提取、傳代及鑒定

采用組織塊培養(yǎng)法提取原代pMSCs。無(wú)菌條件下剪開(kāi)胎盤蛻膜，選擇胎盤胎兒面，用小剪刀去掉結(jié)締組織并剪為1 mm3左右的組織塊，用含10%青鏈霉素的PBS 反復(fù)沖洗，將組織塊均勻接種于10 cm培養(yǎng)皿，加含10%FBS 的DMEM 8 mL，37 ℃、5%CO2及飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)，5 d 換液1 次，第10 天組織塊周圍有細(xì)胞爬出，并逐漸增多。待爬出細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)皿底70%～80%時(shí)去除組織塊，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞并傳代，以后每隔3 ～5 d 傳一代。取第3 代pMSCs，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特征，并進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志檢測(cè)。

收集第3 代pMSCs，細(xì)胞計(jì)數(shù)后取各管為1 ×106細(xì)胞，小鼠血清5 mL 封閉15 min 后，分別加入鼠抗人PE 標(biāo)記單克隆抗體HLA-DR，F(xiàn)ITC 標(biāo)記抗體CD31，CD34，CD44，CD45，CD29 各20 μL，分別設(shè)PE、FITC 空白對(duì)照組，4 ℃避光孵育30 min，PBS 洗滌1 次，1000 r/min 離心10 min，棄上清，加入200 μL PBS 吹打混勻細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型。

1.3 倒置顯微鏡觀察不同氧濃度下pMSCs 的形態(tài)

實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)分為低氧培養(yǎng)和常氧培養(yǎng)兩部分。常氧組為21%O2，低氧部分再分為5%O2組;3%O2組;1%O2組;0.5%O2組。取第3 代pMSCs 消化后，用含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度接種于35 mm 培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿加入2 mL 細(xì)胞懸液，接種細(xì)胞數(shù)為0.3 ×106個(gè)。按照分組情況，分別將培養(yǎng)皿放入不同氧濃度的培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)72 h 后，取出細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4 MTT 檢測(cè)不同氧濃度對(duì)pMSCs 增殖的影響

取第3 代pMSCs 消化后，用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液配制成4 ×104個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔加入200 μL 細(xì)胞懸液，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。按照分組情況，將細(xì)胞放置于不同氧濃度的培養(yǎng)箱中，72 h 后，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，振蕩10 min，充分溶解后于酶標(biāo)儀490 nm 處測(cè)定各孔調(diào)零后的光吸收度值(OD 值)。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同氧濃度對(duì)pMSCs 遷移能力的影響

用marker 筆在24 孔培養(yǎng)板背側(cè)劃線，0. 5 ～1.0 cm 一道，劃線橫穿孔，用0.25%胰酶消化第3代pMSCs，調(diào)整細(xì)胞濃度后接種于24 孔板，5 ×104個(gè)/孔，過(guò)夜，第2 天用200 μL 槍頭垂直劃痕，PBS洗3 次后換10%血清DMEM 培養(yǎng)液，置于37 ℃，5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱0 h、12 h 及24 h 后照相。

1.6 ELISA 檢測(cè)不同氧濃度對(duì)pMSCs 分泌VEGF的影響

用0.25%胰酶消化第3 代pMSCs，調(diào)整細(xì)胞濃度2×105個(gè)/mL，取100 μL 細(xì)胞懸液接種于96 孔板，將細(xì)胞放置于不同氧濃度的培養(yǎng)箱中，72 h 后收集細(xì)胞上清，按照說(shuō)明書(shū)，ELISA 檢測(cè)VEGF 的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次以上，數(shù)據(jù)用±s 表示，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 pMSCs 的提取、傳代及鑒定

胎盤組織塊接種后，約10 d 組織塊周圍有少量細(xì)胞爬出，短梭形。隨后細(xì)胞密度增加，細(xì)胞逐漸伸展(圖1A)。傳代后細(xì)胞形態(tài)趨于一致，第3 代pMSCs 為梭形，胞體大而扁平，類似于成纖維細(xì)胞。細(xì)胞排列規(guī)則(圖1B)。利用流式細(xì)胞儀對(duì)第3 代pMSCs 進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志檢測(cè)，結(jié)果表明:pMSCs 陽(yáng)性表達(dá)CD29 及CD44(圖2)，而CD31、CD34、CD45及HLA-DR 呈陰性。

2.2 不同氧濃度對(duì)pMSCs 形態(tài)的影響

常氧時(shí)pMSCs 多為梭形，偶見(jiàn)多角形(圖3A)。不同濃度低氧培養(yǎng)中的pMSCs 形態(tài)相似，細(xì)胞縱向伸展，呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞形態(tài)更均一，排列更整齊，漩渦狀排列更明顯(圖3B ～E)。

圖1 組織塊培養(yǎng)第10 天及第3 代pMSCs (×100)Fig 1 Tissue cultured for 10 days and the third passage pMSCs (×100)

圖2 流式細(xì)胞檢測(cè)pMSCs 的CD29 及CD44 表達(dá)Fig 2 CD29 and CD44 expression of pMSCs by flow cytometry

圖3 pMSCs 在常氧及低氧培養(yǎng)中的形態(tài)Fig 3 Morphology of pMSCs in normoxic or hypoxic culture

2.3 不同氧濃度對(duì)pMSCs 增殖的影響

與常氧培養(yǎng)的pMSCs 相比，5%O2，3%O2及1%O23 組中pMSCs 的增殖能力均明顯增強(qiáng)，差異有顯著性意義，P ＜0.05;0.5%O2中的pMSCs 增殖能力明顯減弱，差異有顯著性意義，P ＜0.05。低氧培養(yǎng)中，1%O2pMSCs 的增殖能力明顯強(qiáng)于3%O2組及5%O2組;3%O2pMSCs 的增殖能力強(qiáng)于5%O2組，差異均有顯著性意義，P ＜0.05。見(jiàn)圖4。

2.4 不同氧濃度對(duì)pMSCs 遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)24 h 后，常氧培養(yǎng)的pMSCs 有部分細(xì)胞發(fā)生遷移。與常氧pMSCs 相比，5%O2，3%O2及1%O2培養(yǎng)的pMSCs向劃痕區(qū)遷移的細(xì)胞明顯增多，且氧濃度越低，遷移細(xì)胞越多。而0. 5%O2中pMSCs 向劃痕區(qū)遷移的細(xì)胞與常氧組相比，無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖5。

圖4 pMSCs 在不同氧濃度下的增殖能力Fig 4 The proliferation of pMSCs in different oxygen concentrations

圖5 pMSCs 在不同氧濃度下的遷移能力Fig 5 The migration ability of pMSCs in different oxygen concentrations

2.5 不同氧濃度對(duì)pMSCs 分泌VEGF 的影響

與常氧培養(yǎng)的pMSCs 相比，5%O2，3%O2及1%O2中pMSCs 分泌VEGF 的能力明顯增強(qiáng)，差異有顯著性意義，P ＜0.05。3%O2組pMSCs 分泌VEGF 多于5%O2組;1%O2組pMSCs 分泌VEGF 多于3%O2組，差異均有顯著性意義，P ＜0.05。與常氧培養(yǎng)的pMSCs 相比，0.5%O2組pMSCs 分泌的VEGF 明顯減少，差異有顯著性意義，P ＜0.05。見(jiàn)圖6。

圖6 pMSCs 在不同氧濃度下VEGF 的分泌表達(dá)量Fig 6 The secretion of VEGF by pMSCs in different oxygen concentrations

3 討 論

MSCs 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的干細(xì)胞，增殖能力強(qiáng)，并可分化為多種細(xì)胞，對(duì)許多疾病有治療作用，在再生醫(yī)學(xué)中有很好的應(yīng)用前景。胎盤是產(chǎn)后“廢棄物”，胎盤中也存在MSCs，pMSCs 因增殖能力強(qiáng)且取材對(duì)人體無(wú)損傷，符合倫理要求，成為當(dāng)前MSCs 研究的熱點(diǎn)，是組織工程理想的細(xì)胞來(lái)源。氧是調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能的重要因素［7］。細(xì)胞的體外培養(yǎng)通常是在常氧(21%O2)條件下完成，但是正常機(jī)體平均氧濃度為5%，因此，體外常氧培養(yǎng)并不符合細(xì)胞在體內(nèi)所處的低氧微環(huán)境。研究表明，MSCs 輸入體內(nèi)后可對(duì)許多疾病產(chǎn)生治療作用，但其作用機(jī)制并未完全闡明。了解MSCs 在體內(nèi)低氧環(huán)境中的生物學(xué)特性對(duì)于闡明其作用機(jī)制有重要意義。以往關(guān)于MSCs 低氧培養(yǎng)的研究，主要集中在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，關(guān)于低氧培養(yǎng)pMSCs 的相關(guān)研究較少。本實(shí)驗(yàn)從胎盤中提取間充質(zhì)干細(xì)胞，在不同的氧濃度中培養(yǎng)，檢測(cè)pMSCs 在低氧時(shí)的形態(tài)，增殖，遷移，VEGF 分泌表達(dá)量的改變。

本實(shí)驗(yàn)成功地提取并鑒定人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，常氧時(shí)pMSCs 多為梭形，偶見(jiàn)多角形。低氧培養(yǎng)時(shí)pMSCs 形態(tài)更均一，縱向伸展呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞排列更整齊，漩渦狀排列更明顯。不同濃度低氧培養(yǎng)的pMSCs 形態(tài)無(wú)明顯差別。

有研究發(fā)現(xiàn)低氧抑制MSCs 增殖，但更多研究表明低氧促進(jìn)MSCs 增殖。Dos Santos 及Hung等［8-9］發(fā)現(xiàn)低氧(1% ～2%O2)短期內(nèi)即促進(jìn)BMSCs 迅速增殖。因此推測(cè)適度低氧促進(jìn)BMSCs 增殖，但促增殖的低氧濃度及培養(yǎng)時(shí)間還有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果表明，與常氧組相比，5%O2，3%O2及1%O23 組的pMSCs 增殖能力明顯增強(qiáng)，且氧濃度越低，pMSCs 增殖能力越強(qiáng)。而0. 5% O2組pMSCs 的增殖速度明顯慢于常氧組。因此推斷，一定范圍內(nèi)的低氧促進(jìn)pMSCs 增殖，在該范圍內(nèi)，氧濃度越低，pMSCs 增殖能力越強(qiáng)。超出該范圍的低氧則抑制pMSCs 增殖。

MSCs 只有歸巢到損傷組織才會(huì)產(chǎn)生治療作用，細(xì)胞遷移是歸巢的前提。研究表明低氧促進(jìn)pMSCs遷移。王立維等［10］的Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在1%O2時(shí)BMSCs 的遷移能力較20%O2時(shí)明顯增強(qiáng)。Saller 等［11］發(fā)現(xiàn)在三維培養(yǎng)體系中2%O2培養(yǎng)的BMSCs 遷移速率較21%O2明顯增快。本研究結(jié)果表明，在相同時(shí)間內(nèi)，5% O2，3% O2及1% O2組pMSCs 遷移到劃痕區(qū)的細(xì)胞數(shù)明顯多于常氧組，且氧濃度越低，遷移的細(xì)胞數(shù)越多。而0.5%O2組的pMSCs 遷移細(xì)胞數(shù)與常氧組相比，無(wú)明顯區(qū)別。因此推測(cè)一定范圍內(nèi)的低氧促進(jìn)pMSCs 遷移。

現(xiàn)認(rèn)為，干細(xì)胞遷移到損傷組織產(chǎn)生的治療作用更多的是由其分泌的細(xì)胞因子完成的。有研究表明，低氧可促進(jìn)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的分泌，1%O2時(shí)促進(jìn)作用最為顯著。本實(shí)驗(yàn)ELISA 結(jié)果顯示，5%O2，3%O2及1%O2組pMSCs 的VEGF 分泌表達(dá)量明顯多于常氧組，且氧濃度越低，VEGF 分泌越多。而與常氧組相比，0.5%O2組pMSCs 分泌的VEGF 明顯減少，說(shuō)明在一定范圍內(nèi)的低氧促進(jìn)pMSCs 分泌VEGF。

本實(shí)驗(yàn)只是對(duì)缺氧培養(yǎng)pMSCs 生物學(xué)特性的初步探索，還有許多問(wèn)題需要進(jìn)一步明確。如低氧時(shí)pMSCs 的凋亡及其他細(xì)胞因子的分泌情況等。研究這些問(wèn)題，有助于進(jìn)一步了解pMSCs 在體內(nèi)的作用機(jī)制。本研究為pMSCs 在臨床的應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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