姬榮偉，李 暉，王莉芬，唐 穎

(1.西安西電集團(tuán)醫(yī)院 病理科，陜西 西安710077;2.鄭州大學(xué)西亞斯國際學(xué)院護(hù)理學(xué)院，河南 新鄭451150;3.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 病理科，遼寧 大連116027)

胃腸間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)是近十年來逐漸被認(rèn)識的獨(dú)立的臨床病理實體，它包括了以往大部分的胃腸道平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、神經(jīng)鞘瘤等，是發(fā)生于胃腸道的最常見的間葉源性腫瘤，占胃腸道腫瘤的1% ～4%，近年來其發(fā)病率有增高的趨勢［1］。目前，多數(shù)病理學(xué)家和臨床腫瘤學(xué)家都認(rèn)為，所有GIST 都有轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，只有低危惡性的GIST，沒有絕對良性的GIST［2］。GIST對常規(guī)化療和放療極不敏感，治療主要依賴于手術(shù)，但術(shù)后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移率較高，可以產(chǎn)生眾多的帶瘤生存患者，常常需要對腫瘤實施多次手術(shù)。目前一致認(rèn)為，GIST 的主要發(fā)病機(jī)制是c - kit 原癌基因突變，導(dǎo)致酪氨酸激酶持續(xù)活化，細(xì)胞增殖、分化失控所致［3］。研究表明c -kit 基因突變位點主要在外顯子9、11、13、17，其中以外顯子11 最為常見。外顯子11 突變與GIST 的生物學(xué)行為、預(yù)后以及藥物治療效果密切相關(guān)。有關(guān)c-kit 基因表達(dá)和基因突變與GIST 臨床病理特點的關(guān)系，研究報道較多，但結(jié)果差異較大，尤其外顯子11 突變與c-kit 基因表達(dá)量以及它們與GIST 臨床病理的關(guān)系，研究報道較少。本研究的目的是從蛋白水平和mRNA 轉(zhuǎn)錄水平研究胃腸間質(zhì)瘤c -kit 基因表達(dá)和外顯子11 突變與臨床病理的關(guān)系，尤其外顯子11 突變和c -kit基因表達(dá)之間的關(guān)系，探討從基因表達(dá)(蛋白和mRNA)水平預(yù)測c -kit 基因突變和腫瘤生物學(xué)行為的可能性，為GIST 的治療和判斷預(yù)后提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2010—2014年大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理資料完整、診斷明確的GIST 組織蠟塊60 例(其中包括2009年手術(shù)切除新鮮GIST 組織標(biāo)本15例)，對照組標(biāo)本為正常胃壁組織、胃平滑肌瘤、胃神經(jīng)鞘瘤及胃神經(jīng)纖維瘤各1 例。所有患者術(shù)前均未接受化療和放療。

1.2 藥物和試劑

兔抗人CD117 多克隆抗體工作液(基因科技有限公司)。P0013 Western 及IP 細(xì)胞裂解液、P0012A SDS-PAGE 凝膠配置試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)?？俁NA 提取試劑(invitrgen 公司)。K1611 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、外顯子11 RT-PCR 引物(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。GAPDH 引物、150 bpDNA Ladder Marker 和DR001AM taq 酶(寶生物工程有限公司)。

1.3 主要儀器

MG25 +基因擴(kuò)增儀(杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)。KDC -160HR 高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)。PCR 儀(香港Termo Hybaid)。瓊脂糖電泳儀JM - 250 型、單垂直板式PAGE 電泳儀MV - Ⅲ型(大連捷邁科貿(mào)有限公司)。UV-2450 島津紫外可見分光光度儀(島津國際貿(mào)易有限公司)。

1.4 方 法

1.4.1 GIST 分化程度和侵襲危險性分級:根據(jù)腫瘤細(xì)胞的密度、異型性、有無出血和壞死等，將腫瘤分為高分化組和低分化組;同時采用2006年Miettinen 分級方案［4］進(jìn)行GIST 危險性分級，在核分裂最活躍的區(qū)域隨機(jī)觀察50 個高倍鏡視野(HPF)計數(shù)核分裂。

1.4.2 免疫組織化學(xué)染色檢測KIT(即CD117)的表達(dá):按照EnVision 二步法試劑盒說明，同時以PBS代替一抗作陰性對照。KIT 陽性判斷標(biāo)準(zhǔn):KIT 表達(dá)部位為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，陽性表達(dá)呈黃色或棕黃色顆粒。根據(jù)染色強(qiáng)度由淡黃色至棕褐色定為(+)～(+ + +)。

1.4.3 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western -blot)檢測KIT的表達(dá):對手術(shù)切除15 例新鮮GIST 組織標(biāo)本提取全蛋白。40 μg 總蛋白質(zhì)進(jìn)行10%SDS -PAGE 分離，電轉(zhuǎn)移至NC 膜 上，印跡膜用5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，1∶100稀釋的兔抗人KIT，1∶100稀釋的兔抗人Actin 一抗37 ℃水浴箱保溫2 h，TBS 洗滌3次，每次5 min。1∶2000稀釋的羊抗兔二抗室溫?fù)u床溫育1 h，TBS 洗滌3 次，DAB 避光顯色。結(jié)果掃描，用Quantity One 圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析，以目的條帶(KIT)與內(nèi)參(Actin)條帶灰度值的比值判斷KIT 蛋白的表達(dá)量。實驗重復(fù)3 次。

1.4.4 半定量RT -PCR 檢測KIT 的mRNA 表達(dá)水平:對手術(shù)切除15 例新鮮GIST 組織標(biāo)本及3 例石蠟包埋標(biāo)本提取總RNA。3 μg 總RNA 用K1611反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。PCR 反應(yīng)條件如下:95℃4 min 預(yù)熱變性;然后進(jìn)行35 個循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94 ℃30 s，56 ℃30 s(石蠟包埋組織則為50 ℃30 s)，72 ℃30 s;72 ℃10 min。RT -PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳(含0.5 μg/mL 溴化乙錠)，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相，用Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析，以目的條帶(外顯子11)與內(nèi)參條帶(GAPDH)的比值判斷c - kit 基因mRNA 表達(dá)量。實驗重復(fù)3 次。所用引物見表1。

表1 RT-PCR 引物序列Tab 1 RT-PCR primer sequence

1.4.5 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)(PCR -SSCP)法進(jìn)行c-kit 基因外顯子11 突變判定:對石蠟包埋標(biāo)本及手術(shù)切除15 例新鮮GIST 組織標(biāo)本提取基因組DNA 并制備c-kit 基因外顯子11PCR 產(chǎn)物(外顯子11 引物設(shè)計參照文獻(xiàn)［5］，上游序列:5’CCAGAGTGCTCTAATGACTG 3’，下 游 序 列:5’TGACATGGAAAGCCCCTGTT 3’，全 長225 bp)。PCR 反應(yīng)條件如下:95 ℃4 min 預(yù)熱變性，然后進(jìn)行40 個循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94 ℃30 s，52 ℃30 s(石蠟包埋組織為50 ℃30 s)，72 ℃30 s，72 ℃10 min。取3 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，140 V 恒壓18 h 后銀染色至條帶清晰。凡是SSCP 條帶有單鏈條帶泳動變位、缺失或多帶提示該標(biāo)本存在突變。

1.4.6 c -kit 基因外顯子11 測序?qū)CR -SSCP檢測結(jié)果進(jìn)行驗證:選擇4 例標(biāo)本，包括PCR -SSCP 結(jié)果顯示c -kit 基因外顯子11 突變1 例、未突變3 例(GIST2 例和對照組1 例)，同上制備外顯子11 的PCR 產(chǎn)物，送寶生物工程(大連)有限公司測序。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS11.5 統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計學(xué)處理，不同臨床病理特征GIST 患者KIT 蛋白表達(dá)的比較應(yīng)用秩和檢驗，不同臨床病理特征GIST 患者c - kit mRNA 表達(dá)的比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗，不同臨床病理特征GIST 患者c-kit 基因外顯子11 突變的比較應(yīng)用秩和檢驗，檢驗水準(zhǔn)a=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 不同臨床病理特征GIST 患者KIT 蛋白表達(dá)強(qiáng)度的比較

60 例GIST 中，KIT 蛋白全部陽性表達(dá)，4 例對照組織KIT 蛋白全部陰性表達(dá)。不同臨床病理特征GIST 患者KIT 蛋白表達(dá)強(qiáng)度的比較見表2。

2.2 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western -blot)檢測KIT 表達(dá)

15 例GIST、4 例對照組的結(jié)果顯示，GIST 均表達(dá)KIT 蛋白，由分子量分別為120 kD 和145 kD 的兩條帶組成，前者為KIT 前體蛋白，后者為KIT 成熟蛋白(圖1);4 例對照組標(biāo)本均未見KIT 蛋白表達(dá)。KIT 前體蛋白、KIT 成熟蛋白表達(dá)強(qiáng)度與GIST 臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表3。

圖1 Western-blot 顯示KIT 蛋白表達(dá)情況Fig 1 Expression of KIT protein detected by Western-blot

2.3 c-kit 基因mRNA 的表達(dá)

RT-PCR 結(jié)果顯示4 例對照組標(biāo)本可檢測到c-kit基因mRNA 表達(dá);18 例GIST 標(biāo)本(15 例新鮮組織、3 例石蠟包埋組織)均檢測到c -kit 基因mRNA 表達(dá)，其表達(dá)量明顯高于對照組。見圖2。

圖2 對照組及GIST 組c-kit 基因mRNA 表達(dá)Fig 2 mRNA expression of c - kit gene in control groups and GIST groups

2.4 c-kit 基因外顯子11 突變檢測結(jié)果

2.4.1 PCR -SSCP 檢測結(jié)果:c -kit 基因外顯子11 基因組DNA 的PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳，顯示為225 bp 條帶(圖3)。PCR-SSCP 結(jié)果顯示，對照組c-kit 基因外顯子11 呈兩條形狀整齊的單鏈DNA(ssDNA)條帶;均未檢出外顯子11 突變;60例GIST 中共檢出c -kit 基因外顯子11 突變者31例(突變率52% )，表現(xiàn)為c - kit基因外顯子11DNA 單鏈條帶泳動變位、缺失或多帶，見圖4。經(jīng)驗證，PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果與PCR-SSCP 結(jié)果一致。

表2 KIT 蛋白表達(dá)強(qiáng)度與GIST 臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab 2 Relation between expression intensity of KIT protein and clinical pathological parameters in GIST

圖3 c-kit 基因外顯子11 PCR 產(chǎn)物Fig 3 c- kit gene exon 11 PCR products

2.4.2 c-kit:基因外顯子11 突變與GIST 臨床病理特點的關(guān)系:c-kit 基因外顯子11 突變發(fā)生在女性、腫瘤最大徑＞5 cm、核分裂數(shù)＞5/50HPF 及中高度侵襲危險性的GIST 外顯子11 突變率較高，見表4。

2.5 c-kit 基因外顯子11 突變與KIT 蛋白表達(dá)的關(guān)系

Western-blot 檢測KIT 成熟蛋白在c-kit 外顯子11 突變與未突變之間的表達(dá)量差異有顯著性意義(P ＜0.05)，見表5。

圖4 銀染PCR-SSCP 顯示外顯子11 突變檢測結(jié)果Fig 4 The PCR - SSCP silver stain showed exon 11 mutation test results

2.6 外顯子11 突變與c-kit 基因mRNA 表達(dá)的關(guān)系

外顯子11 突變與c -kit 基因mRNA 表達(dá)之間未見相關(guān)性(P ＞0.05)。

3 討 論

c-kit 基因的表達(dá)產(chǎn)物KIT 蛋白，作為GIST 的特征性標(biāo)記物首先得到了人們廣泛重視。KIT 蛋白分子量為145 kD，它由細(xì)胞外區(qū)、跨膜區(qū)、近膜區(qū)和1 個酪氨酸激酶(TK)區(qū)組成。由于KIT 蛋白對GIST 的診斷具有良好的敏感性和特異性，已經(jīng)成為GIST 病理診斷的主要依據(jù)。但是有關(guān)KIT 蛋白表達(dá)量是否與GIST 的臨床病理特點相關(guān)，是否可提示GIST 的危險程度及預(yù)后等研究較少。曹暉等［6］報道，免疫組織化學(xué)研究顯示，KIT 蛋白表達(dá)水平在惡性、良性GIST 間無明顯差異。鄭松等［7］的免疫組化結(jié)果也顯示，KIT 蛋白表達(dá)水平在不同危險程度GIST 間無顯著性差異。本研究中免疫組化結(jié)果顯示60 例GIST 全部表達(dá)KIT 蛋白，陽性率100%，KIT 蛋白的表達(dá)強(qiáng)度在低分化組中高于高分化組(P ＜0.05)，而在GIST 各臨床病理參數(shù)以及各級侵襲危險程度之間無明顯差異，與文獻(xiàn)報道一致［6-7］。提示免疫組化方法檢測KIT 蛋白表達(dá)是診斷GIST的主要依據(jù)之一，其表達(dá)強(qiáng)度也有提示GIST 分化程度的作用。由于免疫組織化學(xué)方法對蛋白表達(dá)半定量敏感性較差，因此，本研究用Western -blot 方法對15 例GIST 的KIT 蛋白表達(dá)量進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KIT 蛋白呈分子量為120 kD 和145 kD 的兩種形式，即KIT 前體蛋白和KIT 成熟蛋白。KIT 成熟蛋白在中-高侵襲危險程度組與極低-低危險程度組表達(dá)差異具有顯著性意義(P ＜0.05)。馮菲等［8］報道用Western - blot 方法檢測KIT 蛋白，在高、低危險程度組間KIT 蛋白表達(dá)量沒有差異，但未涉及KIT 前體蛋白和成熟蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)在GIST 中KIT 蛋白表現(xiàn)為前體(120 kD)和成熟(145 kD)兩種形式與文獻(xiàn)報道相同［9］，前體蛋白是未成熟蛋白，缺少作用于細(xì)胞表面所必需的糖基化基團(tuán)［10］，但是有關(guān)KIT 成熟蛋白和前體蛋白形式與GIST 臨床病理特點以及c -kit 基因突變的關(guān)系鮮見報道。本研究組發(fā)現(xiàn)KIT 成熟蛋白在中-高侵襲危險組的表達(dá)量明顯高于極低- 低危險組，提示KIT 成熟蛋白表達(dá)量增加在GIST 的發(fā)展過程中有著重要作用，可能成為判斷GIST 預(yù)后的參考指標(biāo)。有關(guān)在轉(zhuǎn)錄水平研究c -kit 基因表達(dá)與GIST 臨床病理特點及生物學(xué)行為的關(guān)系，文獻(xiàn)報道甚少。本研究RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，c-kit 基因mRNA 的表達(dá)GIST 顯著高于平滑肌瘤、神經(jīng)鞘瘤等，但是其表達(dá)量與GIST 臨床病理特點之間無明顯關(guān)系，在GIST 各級危險程度中表達(dá)也無明顯差異，與文獻(xiàn)報道相同［8］。

表3 KIT 前體蛋白、KIT 成熟蛋白表達(dá)強(qiáng)度與GIST 臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab 3 Comparison on relation between expression intensity separated in KIT precursor protein and mature protein and clinical pathological parameters in GIST

表4 c-kit 基因外顯子11 突變與GIST 臨床病理特點的關(guān)系Tab 4 The relationship between c-kit exon 11 mutation and clinical pathological features in GIST

表5 Western-blot 檢測KIT 蛋白表達(dá)和c-kit 外顯子11 突變的關(guān)系Tab 5 The relationship between the expression of KIT detected by Western-blot and c-kit exon 11 mutation (±s)

表5 Western-blot 檢測KIT 蛋白表達(dá)和c-kit 外顯子11 突變的關(guān)系Tab 5 The relationship between the expression of KIT detected by Western-blot and c-kit exon 11 mutation (±s)

外顯子11 例數(shù) KIT 前體蛋白表達(dá)量t P KIT 成熟蛋白表達(dá)量t P突變8 1.590 ±0.831未突變 7 0.970 ±0.042 1.000 0.391 2.037 ±0.490 0.810 ±0.057 3.374 0.044

c-kit 基因突變是GIST 發(fā)生的主要機(jī)制，c -kit 基因位于4q12 ～4q13，編碼產(chǎn)物即為KIT 蛋白，是一種跨膜酪氨酸激酶受體，其配體為造血干細(xì)胞生長因子(SCF)，KIT 蛋白與配體結(jié)合后激活酪氨酸激酶，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活化細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子從而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化和增生。研究表明c -kit 基因突變可導(dǎo)致酪氨酸激酶非配體激活，使細(xì)胞異常生長［11］。在GIST 中，c -kit 基因突變占所有突變類型的58% ～92%［12］，突變位點以外顯子11 最為常見。因此，外顯子11 突變與GIST 生物學(xué)行為及預(yù)后之間的關(guān)系是近年來的研究熱點，大部分研究結(jié)果支持外顯子11 突變是患者預(yù)后不良的提示。也有研究認(rèn)為外顯子11 突變更多地見于惡性程度較低的腫瘤，可能提示患者預(yù)后良好［12］。本研究運(yùn)用PCR-SSCP 方法檢測了GIST 中c -kit 基因外顯子11 的突變情況，結(jié)果顯示，60 例GIST 中有31 例發(fā)生了c-kit 基因外顯子11 突變，突變率為52%，外顯子11 突變率分別在腫瘤最大徑＞5 cm、核分裂數(shù)＞5/50 HPF 組明顯高于腫瘤最大徑≤5 cm、核分裂數(shù)≤5/50 HPF 組;在高侵襲危險性GIST 組中突變率明顯高于低危險性組，結(jié)果與文獻(xiàn)報道相同［13-14］，提示c-kit 基因外顯子11 突變在GIST 的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用，可作為GIST 危險程度分級的參考指標(biāo)。

大量研究表明外顯子11 突變的意義還關(guān)系到靶向治療藥物甲磺酸伊馬替尼治療GIST 的效果。研究證明外顯子11 突變的患者藥物治療緩解率明顯高于其它外顯子突變及未檢出突變的患者［15］，并且源于胃的GIST 中外顯子11 缺失突變比點突變者有更高的緩解率［16］。由于c -kit 基因直接編碼的蛋白即為KIT 蛋白，同時甲磺酸伊馬替尼作為一種酪氨酸蛋白激酶抑制劑，作用于不同突變類型患者所產(chǎn)生的不同療效，使得人們開始尋求c -kit 基因突變與KIT 蛋白表達(dá)之間的關(guān)系。有研究顯示在c-kit 基因突變的腫瘤中KIT 蛋白大多高表達(dá)［17］，但目前尚未見有明確的研究結(jié)果。本組實驗分析了外顯子11 突變與c-kit 基因表達(dá)之間的關(guān)系，結(jié)果表明:在免疫組化、半定量RT -PCR 的檢測中突變組與未突變組間c-kit 基因表達(dá)均無明顯差異;但是Western-blot 結(jié)果顯示，突變組KIT 成熟蛋白表達(dá)量高于未突變組，提示KIT 蛋白在GIST 發(fā)生、發(fā)展過程中所起的作用并非與蛋白表達(dá)總量有關(guān)，而是與KIT 蛋白的活化狀態(tài)(磷酸化)有關(guān);同樣，c -kit 基因突變對GIST 生物學(xué)行為的影響可能與KIT蛋白表達(dá)量無明顯關(guān)系，而是與KIT 蛋白的翻譯后成熟和轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)。

由于c-kit 突變致病機(jī)制是GIST 的主要發(fā)生機(jī)制，因此探討c-kit 基因表達(dá)、外顯子11 突變與GIST 臨床病理特點之間的關(guān)系有著重要意義［25］。本研究結(jié)果可以為臨床判斷GIST 的預(yù)后和預(yù)測靶向治療藥物-伊馬替尼的療效提供有意義的線索和依據(jù)。由于本研究例數(shù)較少，上述結(jié)果有待于擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究和驗證。

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