季英楠，阿 良，趙忠海，鄧純博

(沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院 骨外二科，遼寧 沈陽110000)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是目前公認(rèn)的疑難病之一，它具有高發(fā)生率、高致殘率、高耗費率等特點，所以加強SCI 發(fā)病機制及損傷修復(fù)的研究具有十分重要的意義。脊髓損傷分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩個階段。繼發(fā)性損傷是脊髓原發(fā)性損傷之后，由于各種因素引起的脊髓再損傷，所產(chǎn)生的脊髓損害遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了原發(fā)性損傷。SCI 繼發(fā)性損傷病理過程中，β-淀粉樣前體蛋白(β -APP)和超敏C 反應(yīng)蛋白(hs-CRP)可作為一種快速反應(yīng)性蛋白而誘導(dǎo)增高，聚集于局部損傷區(qū)域及周邊。SCI后受到損傷、炎性反應(yīng)等因素影響，血-脊髓屏障破壞，血管通透性增加，血液中β -APP、hs -CRP 在SCI 早期明顯升高。本研究通過測定β - APP 及hs-CRP 血清動態(tài)變化，探究其與SCI 損傷程度的相關(guān)性，為進一步探討β -APP、hs -CRP 水平在脊髓繼發(fā)損傷機制中的作用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

大鼠β - APP 定量檢測ELISA 試劑盒、大鼠hs-CRP定量檢測ELISA 試劑盒，酶標(biāo)儀，動脈夾(35 g、95 g)，高速低溫離心機，37 ℃恒溫箱。

1.2 動物模型建立及功能評定

取雌性SD 大鼠90 只，體質(zhì)量為260 ～280 g，隨機分為3 組(每組30 只):重度損傷組、輕度損傷組和假手術(shù)組。麻醉滿意后，動物取俯臥位。取脊柱正中縱形切口，暴露術(shù)野，確定T10椎板棘突后，切斷T10～T11棘間韌帶，并去除部分T11棘突，用有齒鑷夾持T10棘突并稍向上提起，使T10～T11關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)分離，小心咬除T11上關(guān)節(jié)突外側(cè)緣部分骨質(zhì)，使T10下關(guān)節(jié)突下緣出現(xiàn)空隙，并以此為突破口向上咬除T10椎板，使T10脊髓充分暴露，輕度脊髓損傷組用35 g動脈夾夾持脊髓約30 s，重度脊髓損傷組用95 g 動脈夾夾持脊髓約30 s?？梢姶笫蠹顾韬笳徐o脈變細(xì)，尾巴逐漸卷曲翹起，雙后肢出現(xiàn)抽搐，隨后雙后肢及尾巴松弛癱軟，提示制模成功，縫合切口。假手術(shù)組僅行椎板咬除，術(shù)畢縫合切口。術(shù)后飲水不限、飼料定量給予(預(yù)防腸梗阻)，墊料保持干燥、每天擠壓膀胱排尿3 次，直至排尿反射恢復(fù)。各組中大鼠如死亡，及時補充。分別在術(shù)后12 h、24 h、3 d 、7 d、14 d，根據(jù)后肢體位、活動方式、活動范圍等對所有手術(shù)動物進行BBB 功能評分。

1.3 ELISA 血清制備及檢測

檢測不同程度SCI 大鼠傷后血清β - APP 和hs-CRP 含量變化。取SCI 后12 h、24 h、3 d、7 d 和14 d 的血清、96 孔的酶標(biāo)包被板，固定于框架上，分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣本孔和空白對照孔，記錄各孔位置，在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加人標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，待測樣本孔中先加入待測樣本10 μL 及樣本稀釋液40 μL(樣本稀釋5 倍)。根據(jù)β-APP 和hs-CRP ELISA檢測試劑盒說明書進行操作，在酶標(biāo)儀上于450 nm波長處以陰性對照孔調(diào)0，檢測各孔OD450值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD 值標(biāo)準(zhǔn)得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出各組濃度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，各組不同時間點血清β-APP 含量和hs - CRP 含量比較采用One -way ANOVA 方差分析，兩兩比較采用t 檢驗，P ＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BBB 評分

重度損傷組分別與輕度損傷組、假手術(shù)組比較，各時間點差異均有顯著性意義(P ＜0.05)。見表1。

表1 3 組動物不同時間點BBB 評分的比較Tab 1 The BBB scores at different time points in three groups (±s，n=9)

表1 3 組動物不同時間點BBB 評分的比較Tab 1 The BBB scores at different time points in three groups (±s，n=9)

1)與假手術(shù)組比較，P ＜0.05;2)與輕度損傷組比較，P ＜0.05

分組12 h 24 h 3 d 7 d 14 d重度損傷組 0.00 ±0.001)2) 0.00 ±0.001)2) 1.23 ±0.331)2) 2.23 ±0.561)2) 2.59 ±0.521)2)輕度損傷組 2.30 ±0.321) 3.12 ±0.391) 3.52 ±0.311) 4.06 ±0.481) 4.23 ±1.021)假手術(shù)組 20.00 ±0.02 21.00 ±0.00 21.00 ±0.00 21.00 ±0.0 0 21.00 ±0.00

2.2 血清β-APP 測定結(jié)果

SCI 后12 h 血清β -APP 含量明顯升高，24 h達(dá)到高峰值，隨后逐漸下降，14 d 時重度損傷組仍明顯高于假手術(shù)組，輕度損傷組趨于正常水平。輕度損傷組除14 d 時與假手術(shù)組比較差異無顯著性意義(P ＞0.05)外，其余各時間點與假手術(shù)組比較差異均有顯著性意義(P ＜0.05)。重度損傷組分別與輕度損傷組、假手術(shù)組比較，各時間點差異均有顯著性意義(P ＜0.05)。見表2、圖1。

2.3 血清hs-CRP 測定結(jié)果

SCI 后12 h 血清hs-CRP 含量明顯升高，3 d 達(dá)峰值，隨后逐漸下降，14 d 時重度損傷組仍明顯高于假手術(shù)組，輕度損傷組14 d 時趨于正常水平。輕度損傷組除14 d 時與假手術(shù)組比較差異無顯著性意義(P ＞0.05)外，其余各時間點與假手術(shù)組比較差異均有顯著性意義(P ＜0.05)。重度損傷組分別與輕度損傷組、假手術(shù)組比較，各時間點比較差異均有顯著性意義(P ＜0.05)。見表3、圖2。

表2 3 組動物不同時間點血清β-APP 含量的比較Tab 2 The serum level of β-APP at different time in three groups (ng/mL，±s)

表2 3 組動物不同時間點血清β-APP 含量的比較Tab 2 The serum level of β-APP at different time in three groups (ng/mL，±s)

1)與假手術(shù)組比較，P ＜0.05;2)與輕度損傷組比較，P ＜0.05

分組12 h 24 h 3 d 7 d 14 d重度損傷組 1200 ±101)2) 2310 ±151)2) 2112 ±261)2) 1680 ±91)2) 1189 ±151)2)輕度損傷組 1100 ±131) 2210 ±131) 1913 ±191) 1413 ±141) 1010 ±30假手術(shù)組1012 ±27 1011 ±19 1029 ±21 1022 ±18 1010 ±24

表3 3 組動物不同時間點血清hs-CRP 含量的比較Tab 3 The serum level of hs-CRP at different time in three groups (ng/mL，±s)

表3 3 組動物不同時間點血清hs-CRP 含量的比較Tab 3 The serum level of hs-CRP at different time in three groups (ng/mL，±s)

1)與假手術(shù)組比較，P ＜0.05;2)與輕度損傷組比較，P ＜0.05

分組12 h 24 h 3 d 7 d 14 d重度損傷組 32.51 ±0.691)2) 37.56 ±0.491)2) 79.23 ±0.531)2) 50.13 ±0.561)2) 34.56 ±0.521)2)輕度損傷組 30.25 ±0.321) 34.49 ±0.491) 67.61 ±0.511) 48.42 ±0.471) 30.41 ±1.01假手術(shù)組 29.34 ±1.38 29.30 ±1.48 28.60 ±1.49 28.89 ±1.4 7 30.01 ±1.23

圖1 3 組動物不同時間點血清β-APP 含量變化Fig 1 The dynamic change of β-APP in serum at different time points

圖2 3 組動物不同時間點血清hs-CRP 含量變化Fig 2 The dynamic change of hs-CRP in serum at different time points

3 討 論

合理的SCI 動物模型是開展研究的前提，理想的動物模型制作方法應(yīng)具有以下特點［1］:(1)與臨床相近;(2)步驟客觀化;(3)制作的模型一致性高;(4)壓迫力度、時間可自行控制，可產(chǎn)生不同程度的損傷，壓迫程度大小與脊髓程度損傷程度成線性關(guān)系;(5)操作簡單;(6)經(jīng)濟實用。通過BBB 評分各組比較，重度損傷組分別與輕度損傷組、假手術(shù)組比較，各時間點比較差異均有顯著性意義，說明動物模型建立成功，并與脊髓損傷臨床表現(xiàn)相近，提示動脈夾鉗夾脊髓損傷模型建立法更接近臨床脊髓損傷機制，能更好的模擬繼發(fā)性SCI 病理變化過程，具有良好的可行性及重復(fù)性，且經(jīng)濟實用。

β-APP 是一種相對分子質(zhì)量為110 ～130 kD的大分子膜整合糖蛋白［2］，人體大多數(shù)細(xì)胞中可表達(dá)微量β -APP，它普遍存在于血液和腦脊液中，過去常用于對阿爾茨海默病及顱腦損傷的研究［3］。近年研究發(fā)現(xiàn)，血清β-淀粉樣前體蛋白(β amyloid precursor protein，β -APP)和超敏C 反應(yīng)蛋白(hypersensitive-cross-reactive protein，hs -CRP)作為急性期蛋白在脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)后繼發(fā)性損傷階段引起病情進一步惡化［4］。繼發(fā)性脊髓損傷是在原發(fā)性損傷后一段時間內(nèi)發(fā)生的包括水腫、炎性反應(yīng)、生化反應(yīng)、免疫反應(yīng)、局部缺血、自由基損傷、細(xì)胞凋亡等一系列復(fù)雜的病理生理過程。SCI 后血腦屏障破壞，其通透性增加，β -APP 大量進入血液循環(huán)，β -APP 作為快速反應(yīng)蛋白，在脊髓繼發(fā)損傷過程中可誘導(dǎo)升高，關(guān)于β -APP 的表達(dá)增加更多學(xué)者認(rèn)為其在SCI 過程中起保護作用。目前β-APP 已知的功能包括:(1)促進神經(jīng)生長或具有神經(jīng)營養(yǎng)活性;(2)誘導(dǎo)神經(jīng)軸突的生長，與神經(jīng)修復(fù)再生有關(guān);(3)參與G 蛋白偶聯(lián)的跨膜信號傳導(dǎo);(4)穩(wěn)定鈣離子通道，調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、抑制凝血等功能［5］。但其可異常水解產(chǎn)生大量Aβ，Aβ 被認(rèn)為是導(dǎo)致神經(jīng)毒性的始動因子，可引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子失衡，促進氧自由基產(chǎn)生，啟動脂質(zhì)過氧化直接導(dǎo)致神經(jīng)元損害［6］。β-APP 是軸漿運輸功能障礙標(biāo)志物，有研究表明缺血后2 h 即可見到軸索微管裂解，導(dǎo)致β-APP 溢出，造成β -APP 的聚積，故應(yīng)用其檢測受損傷軸索［7］。Graham 等［8］通過對致死型外傷性腦損傷者行免疫組織化學(xué)染色觀察β -APP，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元β -APP 染色陽性最早見于3 h。這也是此實驗選用β -APP 作為SCI 后損傷程度敏感指標(biāo)的基礎(chǔ)。

CRP 是機體遭受創(chuàng)傷或感染后反應(yīng)最為敏感的一種急性時相蛋白，它與炎性反應(yīng)過程密切相關(guān)。當(dāng)機體發(fā)生急性創(chuàng)傷后，IL -6 等炎性細(xì)胞因子可誘導(dǎo)肝臟內(nèi)合成增加，血液CRP 水平明顯增加，但CRP 特異性較差，使其應(yīng)用受到限制。但有研究表明神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞也可產(chǎn)生CRP［9］，這也增加了CRP 用于檢測SCI 后損傷程度的特異性。而有研究表明SCI 后β-APP 的過量表達(dá)與CRP 建立聯(lián)系，即β-APP 的異常表達(dá)產(chǎn)生大量Aβ，誘導(dǎo)IL -1、IL-6 炎性細(xì)胞因子釋放，促進血清CRP 升高［10］，引起各種急性期反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和分子免疫反應(yīng)，產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞毒性，加重脊髓繼發(fā)性損傷，出現(xiàn)脊髓細(xì)胞壞死、軸突碎裂、脫髓鞘和空洞。通過本實驗發(fā)現(xiàn)SCI 后12 h 血清β -APP 含量明顯升高，24 h 達(dá)到高峰值，SCI 后12 h 血清hs -CRP 含量明顯升高，3 d 達(dá)峰值，β-APP 比hs-CRP 更為敏感，輕度損傷組于14 d 可降至正常水平，重度損傷組血清水平仍高于正常，重度損傷組血清含量表達(dá)高于輕度損傷組，提示二者血清含量變化與損傷程度密切相關(guān)。

總之，通過動脈夾鉗夾SD 大鼠脊髓，能夠建立良好的、更接近臨床脊髓損傷機制的模型。急性SCI 大鼠血清β - APP、hs - CRP 水平變化反映了SCI 的嚴(yán)重程度，β-APP 比hs-CRP 的變化敏感。

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