王志東，張騏麒，張子軍，孫 萍，蒲春文

(1. 大連市第六人民醫(yī)院 病理科，遼寧 大連116001;2. 大連市第六人民醫(yī)院 分子生物學(xué)標(biāo)本庫(kù)，遼寧 大連116001;3. 大連市兒童醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 大連116012)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是亞洲第二常見(jiàn)惡性腫瘤。而中國(guó)作為乙肝大國(guó)，在肝炎、肝硬化基礎(chǔ)上，隨病情加劇而發(fā)展成為HCC 的病人眾多，占中國(guó)腫瘤病死率的第二位［1］。因此尋找新的、靈敏度高、特異性強(qiáng)的腫瘤指標(biāo)一直是研究的熱點(diǎn)。新近研究表明，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3，GPC3)和白細(xì)胞分化抗原44 變異體6(CD44v6)參與Wnt 通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［2-3］。本研究利用免疫組化等方法對(duì)GPC3、CD44v6 在HCC 中的表達(dá)進(jìn)行觀察與分析，以探討這兩項(xiàng)指標(biāo)在HCC 的鑒別診斷方面的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集大連市第六人民醫(yī)院病理科2012 -2014年行手術(shù)治療的HCC 標(biāo)本38 例，均為原發(fā)性肝癌患者，其中男性29 例，女性9 例，最大年齡76 歲，最小年齡23 歲，中位年齡54.5 歲。取癌及癌旁2 cm組織，其中癌旁2 cm 組織為肝硬化組織，經(jīng)病理證實(shí)均未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞。

1.2 方 法

所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片厚3 ～5 μm，常規(guī)HE 染色及免疫組化染色。免疫組化染色采用EliVision二步法，操作參照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。一抗GPC3 鼠抗人單克隆抗體(克隆號(hào):MAXIM001MX)、一抗CD44v6 鼠抗人單克隆抗體(克隆號(hào):2F10)及二抗EliVisionTMplus 試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。同時(shí)設(shè)PBS 代替一抗的陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

免疫組化染色采用半定量方法進(jìn)行判定，即:將染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分乘積定為每一例染色的綜合評(píng)分，0 ～2 分為(-)，3 ～5 分為(+)，6 ～9 分為(+ +)，10 ～12 分為(+ + +)。(1)細(xì)胞染色強(qiáng)度分為:標(biāo)準(zhǔn)無(wú)色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分;(2)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比分為:無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0 分，陽(yáng)性細(xì)胞≤10%為1 分，陽(yáng)性細(xì)胞11% ～50% 為2 分，陽(yáng)性細(xì)胞51% ～75%為3 分，陽(yáng)性細(xì)胞＞75%為4 分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析均采用SPSS for Windows 17.0 軟件分析系統(tǒng)。計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用卡方檢驗(yàn)或Fisher 精確檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman 等級(jí)相關(guān)。P ＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 GPC3 的表達(dá)

GPC3 主要定位于腫瘤細(xì)胞膜與細(xì)胞漿中，偶有細(xì)胞核表達(dá);在癌旁肝硬化組織中僅有少量細(xì)胞膜著色(圖1)。在HCC 高分化組、中分化組、低分化組癌組織內(nèi)的表達(dá)陽(yáng)性率分別為75.0%，87.5%，90.0%(表1)。在癌旁肝硬化組織中無(wú)表達(dá)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，HCC 高分化組、中分化組、低分化組同癌旁肝硬化組比較，差異均有顯著性意義(P ＜0.05)。在癌組織的表達(dá)強(qiáng)度(+、+ +、+ + +)陽(yáng)性率分別為18.4%、42.1%和23.7%。見(jiàn)表1。

圖1 GPC3 在肝癌及癌旁組織中的表達(dá) (×400)Fig 1 The GPC3 expression in HCC and the liver tissue adjacent to carcinoma (×400)

表1 GPC3 在肝細(xì)胞癌組中的表達(dá)Tab 1 The GPC3 expression in HCC

2.2 CD44v6 的表達(dá)

CD44v6 主要定位于癌細(xì)胞胞漿和部分組織間質(zhì)內(nèi)，呈彌漫或散在分布;向組織內(nèi)侵襲的癌細(xì)胞表達(dá)尤為明顯，陽(yáng)性表達(dá)呈彌漫或散在分布的棕黃色顆粒，顏色從淺黃色至棕褐色，在癌旁組織中著色極少(圖2)。在HCC 高分化組、中分化組、低分化組癌組織中表達(dá)的陽(yáng)性率分別為75. 0%、87. 5%、90.0%(表2)。在癌旁肝硬化組織中無(wú)表達(dá)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，肝細(xì)胞癌高分化組、中分化組、低分化組與癌旁肝硬化組比較差異均有顯著性意義(P ＜0.05)。在癌組織的表達(dá)強(qiáng)度(+、+ +、+ + +)陽(yáng)性率分別為15.8%、44.7%和23.7%。見(jiàn)表2。

圖2 CD44v6 在肝癌及癌旁組織中的表達(dá) (×400)Fig 2 The CD44v6 expression in HCC and the liver tissue adjacent to carcinoma (×400)

表2 CD44v6 在肝細(xì)胞癌組中的表達(dá)Tab 2 The CD44v6 expression in HCC

2.3 GPC3 與CD44v6 在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

GPC3 與CD44v6 在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.502，P ＜0.001)。

3 討 論

Glypican - 3(GPC3)作為磷脂酰肌醇聚糖(glypicans，GPC)家族成員之一，參與調(diào)節(jié)多數(shù)腫瘤細(xì)胞的存活、增殖和遷移等生理過(guò)程［4-5］。有研究表明，GPC3 在多數(shù)肝細(xì)胞癌中均有表達(dá)，但在相對(duì)應(yīng)的正常組織或良性病變組織中不表達(dá)［6］。本研究顯示，GPC3 在HCC 中的陽(yáng)性表達(dá)率為84.2%，而癌旁及遠(yuǎn)肝癌組織無(wú)表達(dá)，因此，通過(guò)免疫組化技術(shù)檢測(cè)GPC3 表達(dá)可作為臨床病理診斷HCC 的指標(biāo)之一。

CD44 是具有多重結(jié)構(gòu)與功能的細(xì)胞表面糖蛋白分子，通過(guò)與蛋白酶的對(duì)接、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響［7］。該基因經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄剪接，可形成功能不同的多種亞型;其中，對(duì)含有v6 外顯子的變異體(CD44v6)的研究最為深入，并與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［8］。本研究顯示，CD44v6 在HCC 中陽(yáng)性表達(dá)率為84.2%，而癌旁及遠(yuǎn)肝癌組織無(wú)表達(dá)。Jung 等［9］發(fā)現(xiàn)，CD44v6 與胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、宮頸癌、膀胱癌等腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。而Zhang 等［10］發(fā)現(xiàn)，隨著HCC 惡化程度的發(fā)展，腫瘤免疫表型會(huì)發(fā)生改變，出現(xiàn)E -cad、Cx43 低表達(dá)和CD44v6 高表達(dá)等現(xiàn)象。因此，CD44v6 的表達(dá)對(duì)預(yù)測(cè)HCC 的預(yù)后具有一定意義。

在本研究中，單獨(dú)檢測(cè)GPC3 或CD44v6 均可作為HCC 的鑒別診斷指標(biāo)。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GPC3與CD44v6 在HCC 中的表達(dá)呈正相關(guān)(r =0.502，P ＜0.001)。GPC3 和CD44v6 均通過(guò)Wnt 信號(hào)通路對(duì)癌細(xì)胞的增殖、侵襲及細(xì)胞間的粘合能力發(fā)揮作用。Li 等［11］證實(shí)，GPC3 不僅是HCC 的標(biāo)志物，還可通過(guò)激活Wnt信號(hào)通路促進(jìn)惡性腫瘤的生長(zhǎng)。Song 等［12］通過(guò)研究GPC3 敲低鼠胚胎組織也得到相似結(jié)論，即GPC3 在調(diào)節(jié)Wnt 信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。Todaro 等［13］發(fā)現(xiàn)，CD44v6 在結(jié)直腸癌干細(xì)胞(CR- CSCs)中有表達(dá)，并通過(guò)激活Wnt/β -catenin 信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的繁殖和轉(zhuǎn)移;同時(shí)，提高CD44v6 在CR-CSCs 中的表達(dá)會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移與轉(zhuǎn)移。提示，GPC3 聯(lián)合CD44v6可作為預(yù)測(cè)HCC 發(fā)生指標(biāo)，二者密切相關(guān)，但其相關(guān)機(jī)制尚不清楚。

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