牛偉濤

（邢臺學院化學工程與生物技術學院，河北邢臺 054001）

豬干擾素基因的克隆與原核表達載體的構建

牛偉濤

（邢臺學院化學工程與生物技術學院，河北邢臺 054001）

干擾素(Interferon)是一種廣譜抗病毒劑，具有抗腫瘤、抗病毒和免疫調節(jié)等多種作用而被廣泛應用于病毒性疾病的預防和治療。本實驗以豬肝臟組織為材料，提取豬肝臟組織DNA，根據GenBank收錄的豬干擾素基因序列設計特異性引物，以豬肝臟DNA為模板進行高保真擴增得到IFN基因的ORF片段，然后進行了T載體克隆。再利用引入EcoRⅠ、SalⅠ酶切位點的特異性引物對IFN成熟肽段的基因進行亞克隆，經雙酶切、連接、轉化后，成功構建了pET28a-ifn原核表達重組質粒，為干擾素基因的原核表達奠定了基礎。

豬干擾素基因；基因克??；表達載體構建

干擾素是一種細胞因子，具備免疫調節(jié)、抗病毒和抗腫瘤等作用，它是科學家在1957年研究流感病毒干擾現象時發(fā)現的[1]。干擾素是一類分泌型糖蛋白，它主要通過與細胞表面受體相互作用從而使細胞、組織或器官產生一種或幾種抗病毒的蛋白，這樣便可以增強免疫應答[2]。干擾素主要由激活的胸腺細胞和自然殺傷細胞產生，病毒入侵時，干擾素在短時間內就能讓機體處于抗病毒形態(tài)，并使機體在1～3周時間內抵制病毒反復感染[3]。生物體中廣泛存在干擾素，人、豬、羊等哺乳動物都產生干擾素。我國豬場眾多，大小豬病毒性傳染病隨季節(jié)變化危害較大，種類繁多，給很多養(yǎng)殖戶造成巨大損失，干擾素就成為醫(yī)藥、獸藥市場最具發(fā)展前景的一類生物制劑[4]。如果利用基因工程的方法將豬干擾素基因進行原核表達，可以為豬干擾素的應用研究提供堅實的基礎。

1 實驗器材、試劑

1.1 實驗器材

TC-96/G/HLife Express基因擴增儀（杭州博日科技有限公司），BD-1000超微量核酸蛋白分析儀（北京五州東方科技發(fā)展有限公司），ZX-2020D凝膠成像分析系統(tǒng)等。

1.2 藥品試劑

2×pfu高保真Taq Mix（上海捷瑞生物工程公司）；T4 DNA連接酶、DNA Marker（TaKaRa大連公司）；PCR產物回收試劑盒、DNA提取試劑盒（上海捷瑞生物工程公司）；卡納青霉素、氨芐青霉素（索萊寶生物科技有限公司）等藥品。

2 實驗方法

2.1 基因組DNA的提取

取20 mg豬肝臟組織，用冰冷生理鹽水洗3次，置于液氮中充分研磨，然后參考DNA提取試劑盒說明書方法進行操作，然后置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 干擾素基因的PCR擴增

2.2.1 引物設計

根據Genbank中的豬干擾素基因序列，利用PrimerPremier5.0設計所需特異性引物。豬干擾素基因ORF序列擴增上游引物為5’ATGGCCCCAACCTCAGCCTTC3’；下游引物為5’TCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTC3’。豬干擾素基因成熟肽序列擴增上游引物為5’CGGAATTCTGCGACCTGCCTCAGAC3’，含EcoRⅠ酶切位點；下游引物為5’GCGTCGACTCACTCCTTCTTCCTGAGTC3’，含SalⅠ酶切位點。

2.2.2 PCR擴增

PCR反應體系為：2×PfuTaq Mix，25μl；上下游引物各2μl，模板為1μl，加dd H2O補齊至50μl；

PCR反應程序為：94℃ 5min；94℃ 30sec，52℃30sec，72℃45sec，30個循環(huán)；72℃10min；4℃保存。

2.3 PCR產物的純化

PCR產物參照PCR產物回收試劑盒說明書進行回收，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.4 連接與轉化

連接反應體系：DNA片段3μl；載體1μl；T4 DNA連接酶0.5μl；10×Buffer 0.5μl；dd H2O，1 μl。16℃連接過夜。用CaCl2法制備DH5α感受態(tài)細胞，將連接產物進行轉化。

2.5 酶切鑒定

反應體系：重組質粒12μl；重組質粒12μl；EcoRⅠ1μl；SalⅠ1μl；10×Buffer 2μl；dd H2O2μl。37℃，30min。

3 實驗結果

3.1 干擾素基因的PCR擴增

利用設計的特異性引物，以豬肝臟基因組DNA為模板，對豬干擾素基因的ORF進行PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測并，如圖1所示，在約570bp的位置出現了特異性擴增帶。

圖1 干擾素基因ORF的PCR擴增M：DNA分子量標準；1：PCR產物

3.2 測序結果

將陽性T載克隆進行測序分析，結果顯示，成功克隆得到長為570bp的豬干擾素基因的ORF片段，序列如下：

ATGGCCCCATCCTCAACTCTCCTCACGGTCCT GGTGCTGCTCAGCTGCAATGCCATCTGCTGTCTGG GCTGCAACCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGCTCAT ACCAGGGCCCTGAGGCTCCTGGCACAAATGAGGA GAATCTCCCCCTTCTCCTGCCTGGACCACAGAAGG GACTTTGGATTCCCCCAAGAGGCCTTGGGGGGCA ACCAGGTCCAGAAGGCTCAAGCCATGGCTCTGGT GCATGAGATGCTCCAGCAGACCTTCCAGCTCTTCA GCACAGAGGGCTCGGCTGCTGCCTGGGATGAGAG CCTCCTGCACCAGTTCTGCACTGGACTGGATCAGC AGCTCAGGGACCTGGAAGCCTGTGTCATGCAGGA GGCGGGGCTGGAAGGGACCCCCCTGCTGGAGGAG GACTCCATCCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCACAG ACTCACCCTCTATCTGCAAGAGAAGAGCTACAGC CCCTGTGCCTGGGAGATCGTCAGGGCAGAAGTCA TGAGAGTCTTCTCTTCCTCCACAAACCTGCAAGAC AGACTCAGGAAGAAGGAGTGA

3.3 干擾素成熟肽段基因序列的PCR擴增

利用特異性引物成功擴增到了干擾素成熟肽段基因序列片段，如圖2所示。

圖2 干擾素成熟肽段基因序列的PCR擴增M：DNA分子量標準；1：PCR產物

3.4 重組質粒的鑒定

利用 EcoRⅠ與 SalⅠ限制性內切酶對pET28a-inf重組質粒進行雙酶切實驗，如圖3電泳檢測結果顯示pET28a-inf重組質粒構建成功。

圖3 pET28a-inf重組質粒的鑒定M：DNA分子量標準；1：pET28a-inf質粒的雙酶切產物

4 討論

實驗成功克隆得到豬干擾素基因ORF片段，序列長度為570bp。豬干擾素基因ORF中含有信號肽序列，實驗中利用特異性引物擴增得到成熟肽的編碼序列，擴增產物長度為490bp。限制性雙酶切鑒定表明豬干擾素基因已成功插入pET28a載體，成功構建了pET28a-inf表達載體，這為下一步豬干擾素基因能在原核表達系統(tǒng)進行高效表達打下了堅實的基礎。

參考文獻:

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圖4 CPU SFR Memory

圖5 Internel Memory

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Q78

A

1672-4658(2015)04-0175-03

2015-6-29

邢臺市科學計劃項目（2014ZC019）；邢臺學院科學研究項目（2014）

牛偉濤(1982-)，男，講師，博士在讀，主要從事分子生物學與基因工程研究.