論著

不同時間持續(xù)缺氧對3T3-L1脂肪細胞脂肪因子基因表達的影響

肥胖是由于能量代謝平衡失調(diào)，攝入過多和/或耗能不足致使脂肪容量增多的狀態(tài)，常伴有胰島素抵抗（IR）和高胰島素血癥、血脂異常及低度炎性狀態(tài)，是發(fā)展為2型糖尿病和心血管疾病的一個最重要的危險因子。大規(guī)模流行病學調(diào)查研究顯示，肥胖已經(jīng)成為一個全球性健康問題，其發(fā)生率呈逐年增長趨勢[1]。隨著肥胖因素在代謝綜合征和心血管疾病病因中的重要作用越來越被深入地認識，脂肪組織獲得了巨大的科研價值，其中脂肪組織的內(nèi)分泌功能紊亂在肥胖及IR中所起的作用受到越來越多的關注。脂肪因子是內(nèi)臟脂肪組織分泌的活性產(chǎn)物，脂肪細胞分泌脂肪因子失衡與代謝綜合征、2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展存在著密切的聯(lián)系。Trayhurn等[2]認為缺氧是肥胖者脂肪因子調(diào)節(jié)紊亂的重要始動因素，并由此誘導了脂肪組織炎癥反應發(fā)生，導致IR的發(fā)生。本研究通過建立持續(xù)低氧脂肪細胞模型，模擬肥胖組織缺氧變化，探討不同時間持續(xù)缺氧對3T3-L1細胞表達脂肪因子水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 3T3-L1脂肪細胞株由加拿大AmiraKlip教授提供，Hanks液、DMEM高糖購自美國Gibico公司，胎牛血清購自以色列Bioind公司，胰島素、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤（IBMX）、地塞米松溶液購自美國Sigma公司，高純總RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒購自北京天根公司，引物購自北京天一輝遠生物科技有限公司，TOP熒光定量試劑盒 (TransStart?Top Green qPCR SuperMix、Passive Reference Dye)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。主要儀器：細胞孵育箱、缺氧箱（芬蘭熱電公司Thermo Electron Corporation,Model3111），實時定量PCR（qRT-PCR）儀為ABI7500。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 細胞模型選用3T3-L1前脂肪細胞株。將復蘇的3T3-L1前脂肪細胞在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，用含有10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。待觀察到細胞長滿培養(yǎng)瓶底壁，將細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，并每2 d換液1次，觀察細胞生長狀態(tài)。觀察到6孔板中細胞長滿后，繼續(xù)培養(yǎng)2 d。之后加入含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基及含0.5 mmol/L IBMX、0.25μmol/L地塞米松、10mg/L胰島素的分化液，培養(yǎng)48 h，再以含10mg/L胰島素的培基培養(yǎng)48 h。隨后換用含10%FBS的高糖DMEM的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d換液1次。觀察細胞可見在誘導分化10～12 d后，90%以上的3T3-L1細胞內(nèi)含有大量串狀脂滴，呈脂肪細胞表型。對誘導分化14 d后的細胞進行后續(xù)實驗處理。

1.2.2 分組及處理 將細胞分為6組，設置常氧組和缺氧組。常氧組為對照組（缺氧0 h），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。缺氧組為實驗組，將細胞分別置于37℃、1%O2、5%CO2、94%N2下分別孵育4、12、24、48 h和72 h。每組6孔。實驗重復3次。

1.2.3 實時定量PCR測定脂肪細胞缺氧誘導因子1α（HIF-1α）、葡萄糖轉(zhuǎn)運子1（GLUT-1）mRNA水平 按照總RNA提取試劑盒步驟提取上述脂肪細胞總RNA，紫外分光光度計檢測確定總RNA濃度及純度。嚴格按照cDNA第一鏈合成試劑盒（20μL體系）說明，取2μgRNA合成cDNA第一鏈。取2 μL合成的cDNA產(chǎn)物及相應的上下游引物（表1）加入20μLTransStart?Top Green qPCR SuperMix體系內(nèi)擴增，條件為94℃30 s，94℃5 s，60℃34 s，40個循環(huán)，β-actin作為內(nèi)參。以β-actin基因的表達量作為內(nèi)參來校正目的基因的表達量，結(jié)果數(shù)值以Ct值表示，每個時間點做3個復孔，取平均值，結(jié)果以2-ΔΔCt表示。實驗重復3次取平均值。

1.2.4 qRT-PCR測定脂肪細胞脂聯(lián)素、瘦素mRNA水平 提取脂肪細胞總RNA，紫外分光光度計檢測確定總RNA濃度及純度。嚴格按照cDNA第一鏈合成試劑盒（20μL體系）說明，取2μgRNA合成cDNA第一鏈。取2μL合成的cDNA產(chǎn)物及相應的上下游引物（表1）加入20μLTransStart?Top Green qPCRSuperMix體系內(nèi)擴增，條件為94℃30 s，94℃5 s，60℃34 s，40個循環(huán)，β-actin作為內(nèi)參。以βactin基因的表達量作為內(nèi)參來校正目的基因的表達量，結(jié)果數(shù)值以Ct值來表示，每個時間點做3個復孔，取平均值，結(jié)果以2-ΔΔCt表示。實驗重復3次取平均值。

表1 qRT-PCR引物序列Tab 1 Geneprimer sequencesused for qRT-PCR

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析 (One-Way ANOVA)，組間比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時間持續(xù)缺氧后脂肪細胞 HIF-1α、GLUT-1mRNA表達水平變化 與常氧組相比，缺氧培養(yǎng)的脂肪細胞HIF-1α、GLUT-1mRNA表達水平升高，并且在缺氧24 h達到最高水平。72 h缺氧組HIF-1α、GLUT-1mRNA表達水平與常氧組無統(tǒng)計學差異。HIF-1αmRNA表達在4 h缺氧組為常氧組的（1.36±0.34）倍；缺氧12 h為對照組的（2.52± 0.44）倍；24 h缺氧組為對照組的（5.82±0.52）倍；缺氧48 h為常氧組的（4.27±0.39）倍；72 h缺氧組為常氧組的（1.76±0.61）倍。4 h缺氧組HIF-1αmRNA表達較常氧組無統(tǒng)計學差異。12 h缺氧組、24 h缺氧組及48h缺氧組HIF-1αmRNA表達較常氧組及4 h缺氧組均有升高，差異有統(tǒng)計學意義。48 h缺氧組及72 h缺氧組HIF-1αmRNA表達較24 h有所下降，差異有統(tǒng)計學意義，見圖1。GLUT-1mRNA表達缺氧4 h組為對照組（1.14±0.44）倍；缺氧12 h時為常氧組的（2.18±0.43）倍；缺氧24 h組為常氧組的（5.96±0.63）倍；缺氧48 h組為常氧組的（1.71±0.18）倍；72 h缺氧組為常氧組的（1.23±0.15）倍，見圖2。其中12、24、48 h缺氧組GLUT-1mRNA表達升高較常氧組有統(tǒng)計學差異。48 h缺氧組及72 h缺氧組GLUT-1mRNA表達較24 h缺氧組下降，差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 不同時間持續(xù)缺氧孵育后脂肪細胞HIF-1α基因表達Fig 1 Theexpression of HIF-1αat different incubation timeof hypoxia in adipocytes

圖2 不同時間持續(xù)缺氧孵育后脂肪細胞GLUT-1基因表達Fig 2 The expression of GLUT-1 at different incubation time of hypoxia in adipocytes

2.2 不同時間持續(xù)缺氧后脂肪細胞脂聯(lián)素、瘦素mRNA表達水平變化 與常氧組相比，缺氧組脂聯(lián)素mRNA的表達整體呈下降趨勢。脂聯(lián)素mRNA表達水平在4 h缺氧組為對照組的（0.87±0.20）倍；12 h缺氧組為常氧組的（0.35±0.12）倍；缺氧24 h組為常氧組的（0.21±0.09）倍；缺氧48 h組為常氧組的（0.19±0.09）倍；72 h缺氧組為常氧組的（0.61±0.18）倍。與常氧組相比較，缺氧組脂聯(lián)素mRNA表達水平下降，其中12 h缺氧組、24 h缺氧組、48 h缺氧組、72 h缺氧組mRNA的下降較對照組有統(tǒng)計學差異。與24 h、48 h缺氧組相比，72 h脂聯(lián)素mRNA表達有所上升，差異有統(tǒng)計學意義，見圖3。瘦素mRNA的表達缺氧組呈現(xiàn)高于常氧組的趨勢。瘦素mRNA在4 h缺氧組是常氧組的（2.15±0.23）倍；缺氧12 h組是常氧組的（2.64±0.37）倍；缺氧24 h組是常氧組的（5.70±0.52）倍；48 h缺氧組是常氧組的（3.19±0.31）倍；缺氧72 h是常氧組的（3.95±0.30）倍。與常氧組相比，4、12、24、48、72 h缺氧組的瘦素mRNA的表達均有升高，差異均有統(tǒng)計學意義。48 h及72 h缺氧組較24 h缺氧組下降，差異有統(tǒng)計學意義。見圖4。

圖3 不同時間持續(xù)缺氧孵育后脂肪細胞脂聯(lián)素基因表達Fig 3 Theexpression of adiponectin at different incubation time of hypoxia in adipocytes

圖4 不同時間持續(xù)缺氧孵育后脂肪細胞瘦素基因表達Fig 4 The expression of leptin at different incubation time of hypoxia in adipocytes

3 討論

近年來，隨著肥胖及其相關代謝性疾病發(fā)病率的增高，肥胖與IR關系及機制的研究已成為內(nèi)分泌與代謝病領域的焦點問題。在眾多的研究成果中，肥胖導致脂肪組織缺氧，造成脂肪組織的慢性炎癥狀態(tài)，進而參與IR的發(fā)生發(fā)展這一理論得到越來越多的重視?！爸窘M織缺氧”假說是Trayhurn等[2]在2004年提出的，他們認為缺氧是肥胖者脂肪因子調(diào)節(jié)紊亂的重要始動因素，并誘導了脂肪組織發(fā)生炎癥反應。國外實驗室均證明在遺傳性和營養(yǎng)誘導的肥胖小鼠的內(nèi)臟脂肪組織中確實存在缺氧，并且與炎癥因子的升高和脂聯(lián)素的下降密切相關，為支持脂肪組織缺氧假說提供了有力證據(jù)[3]。人體解剖學證實白色脂肪組織血供不豐富，相關研究證明，肥胖者白色脂肪組織中血供并未增加，新生血管不足可導致局部脂肪組織血供不足，造成局部缺氧[4]。另一方面，肥胖患者脂肪細胞直徑增大可達到約150～200μm[5]，氧氣在組織內(nèi)的彌散距離為120 μm[6]，增大的脂肪細胞會形成屏障阻礙氧氣在組織內(nèi)彌散，加重了脂肪組織內(nèi)的缺氧。缺氧誘導脂肪的炎癥因子表達水平的升高[7]，可使內(nèi)皮功能紊亂而進一步使血供減少。內(nèi)皮功能紊亂可能阻礙了胰島素擴血管和招募毛細血管的效應，導致脂肪組織血流減少，加重脂肪細胞的缺氧，介導肥胖者分泌脂肪因子紊亂。3T3-L1前脂肪細胞分離自小鼠胚胎(17～19 d)的Swiss3T3細胞[8]，加入誘導劑特異性地誘導分化后，顯微鏡下可見細胞間質(zhì)豐富，許多三酰甘油脂滴積聚于細胞核周圍，呈現(xiàn)典型的成熟脂肪細胞形態(tài)。3T3-L1前脂肪細胞在形態(tài)學變化、細胞生長、脂質(zhì)積聚及脂肪代謝相關酶的表達都能充分展示人體脂肪細胞的特點，是國際上公認的研究脂肪代謝的細胞模型。本實驗對3T3-L1前脂肪細胞進行不同時間持續(xù)缺氧處理，模擬肥胖狀態(tài)下脂肪組織的缺氧環(huán)境，以此來重點研究在肥胖中，缺氧因素對脂肪細胞表達脂聯(lián)素和瘦素的影響。

在缺氧狀態(tài)下，細胞內(nèi)相關低氧反應基因表達增強，以利于機體對于低氧產(chǎn)生適應能力。HIF-1是由α和β亞基組成的異二聚體，α亞基、β亞基分別屬于功能單位和結(jié)構(gòu)單位。HIF-1α是最重要的氧信號轉(zhuǎn)導因子，對其他因子具有調(diào)控作用，但其表達相對不穩(wěn)定，受到O2調(diào)節(jié)。研究證明，當氧供充分時，HIF-1α發(fā)生脯氨酰羥基化和泛素化，經(jīng)過蛋白酶體途徑迅速降解。而缺氧能增加HIF-1α的穩(wěn)定性，促使HIF-1α轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，促進低氧目標基因的表達[1]。受HIF-1調(diào)控的低氧反應基因有70多種，涉及物質(zhì)代謝、細胞增生、凋亡及血管形成等方面，GLUT-1、VEGF等低氧敏感因子，在轉(zhuǎn)錄水平受HIF-1調(diào)節(jié)，成為較特異的低氧反應標志[9]。本研究以缺氧下HIF-1α、GLUT-1mRNA表達水平增加為依據(jù)，成功構(gòu)建持續(xù)缺氧模型。

脂聯(lián)素由ap M1基因編碼，244個氨基酸殘基組成，在循環(huán)中，以低分子量的6聚體和高分子量的12～18聚體形式存在，是非常重要的脂肪因子，在多種生理過程中起著重要作用，包括改善胰島素敏感性，血管內(nèi)皮功能保護，抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生等[3]。血漿脂聯(lián)素通過兩個不同的受體，即脂聯(lián)素受體1（adiponectin receptor，AdipoR1）和AdipoR2實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導，它們的廣泛表達可以誘導AMPK的磷酸化和激活，從而引起下游一系列分子的改變，刺激葡萄糖的利用和脂肪酸的氧化。AdipoR2基因表達增加了參與肝攝取葡萄糖所有基因的表達。此外，脂聯(lián)素和TNF-α都可由脂肪細胞分泌，并且結(jié)構(gòu)相似，因而可能存在相互拮抗作用，可通過抑制TNF-α在胰島素信號中的作用來改善IR[10]。循環(huán)中脂聯(lián)素水平較高，但肥胖患者血漿脂聯(lián)素水平卻比正常人下降，這與脂肪組織分泌的其它激素是截然相反的，提示內(nèi)臟脂肪的堆積產(chǎn)生了某些脂聯(lián)素生成的抑制因子，進一步導致胰島素敏感性下降、血壓升高、動脈粥樣硬化等[11]。在本實驗中，我們建立不同時間持續(xù)缺氧脂肪細胞模型，研究脂肪缺氧對脂肪細胞表達脂聯(lián)素的影響。結(jié)果顯示缺氧處理的脂肪細胞脂聯(lián)素表達下降，在4～48 h缺氧組中，隨著缺氧時間的延長，脂聯(lián)素的降低更為明顯。缺氧72 h脂肪細胞表達脂聯(lián)素未能繼續(xù)下降，可能與細胞狀態(tài)有關，細胞對缺氧反應敏感性較缺氧24 h及48 h差。通過以上數(shù)據(jù)可以得出：肥胖狀態(tài)下，脂肪組織缺氧是一個非常重要的脂聯(lián)素生成的抑制因子。在細胞狀態(tài)良好的前提下，缺氧時間越長，脂肪組織脂聯(lián)素生成降低越明顯。

瘦素是主要由白色脂肪組織分泌產(chǎn)生的、由ob基因編碼(位于人類基因7q32)的、166或167個氨基酸組成的分泌型蛋白質(zhì)類激素，分子量約14～16kD[12]。瘦素進入血液循環(huán)后，通過多種組織上、多種形式的瘦素受體作用于中樞及外周多種位點，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)機體能量代謝、維持正常生殖功能、促進血管生成、提高免疫力等生理學作用。瘦素作用于其位于下丘腦的受體后，可以激活PI3K信號通路，從而增強脂肪酸的氧化，增加機體對葡萄糖的攝取利用；同時，瘦素可以發(fā)揮抑制食欲及刺激能量消耗的作用，因此，它是機體調(diào)控體質(zhì)量的主要的活性因子之一。另一方面，瘦素與其受體的結(jié)合還可以明顯抑制IL-1介導炎癥通路的表達，從而發(fā)揮強大的抗炎作用[13]。因此，瘦素從理論上講也被認為是一種重要代謝相關性的保護因子。然而，研究表明，血清瘦素濃度與肥胖程度（如體質(zhì)量指數(shù)、體脂百分含量）呈顯著正相關，肥胖個體血清瘦素水平大約是正常體質(zhì)量者的2倍，是消瘦者的3倍或＞3倍，這可能是由于瘦素調(diào)節(jié)機體脂肪代謝的脫逸作用所致[14]。瘦素在脂肪組織和胰島素之間起負反饋的信號傳遞作用，由于肥胖患者的瘦素受體對瘦素不敏感，負反饋機制受到破壞，瘦素不能有效抑制胰島細胞的胰島素分泌，導致高胰島素血癥及IR。對于肥胖時脂肪細胞分泌瘦素升高的機制，缺氧機制發(fā)揮了重要作用，本實驗顯示缺氧孵育脂肪細胞后瘦素mRNA表達水平較常氧條件下明顯升高，并且有一定的時間依賴性，在24 h時升高達到最大水平。

本研究團隊主要研究肥胖-脂肪缺氧與IR之間的聯(lián)系，在以往的工作中對脂肪細胞缺氧與代謝紊亂方面的研究取得了一些成果[15-16]。本次實驗主要模擬肥胖-脂肪缺氧時脂肪細胞持續(xù)缺氧狀態(tài)，設定不同缺氧時間，分析持續(xù)缺氧狀態(tài)對脂肪組織合成脂聯(lián)素及瘦素的影響。一方面通過HIF-1α和GLUT-1等低氧敏感因子的表達增高為依據(jù)，成功構(gòu)建了脂肪細胞缺氧模型。不同時間缺氧處理脂肪細胞后，脂肪細胞表達脂聯(lián)素下降，瘦素表達升高，提示在肥胖中脂肪組織缺氧是導致脂肪組織分泌脂肪因子紊亂的重要因素；另一方面，由于脂肪細胞體外培養(yǎng)的的特殊性，脂肪細胞的對外部刺激的反應，還需要考慮到細胞本身狀態(tài)。綜合以上因素，本實驗證明缺氧介導的脂肪細胞各種內(nèi)分泌功能變化，在24 h時最為明顯，這為下一步進行肥胖-脂肪組織相關研究時脂肪細胞缺氧處理時間的選擇提供參考。預防和治療肥胖及與其密切相關的胰島素抵抗已經(jīng)成為全世界關注的難題。盡管對肥胖-胰島素抵抗的相關研究正在逐年增加，但是進展依然緩慢。本研究團隊主要致力于對肥胖-脂肪缺氧的機制研究，希望能夠為肥胖-胰島素抵抗等代謝問題的預防及治療提供理論依據(jù)。

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（2014-09-12收稿）

楊傳慧1，李 萍1，何 慶1，劉金泉2，牛文彥2

（1.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院內(nèi)分泌科，天津300052；2.天津醫(yī)科大學免疫學系，天津300070）

目的：探討不同時間持續(xù)缺氧孵育后脂肪細胞脂聯(lián)素和瘦素表達的變化。方法：將分化成熟的3T3-L1脂肪細胞隨機分為6組，即常氧（21%O2）組和缺氧（1%O2）4、12、24、48、72 h組，實時定量PCR（qRT-PCR）法測定各時間點脂肪細胞中缺氧誘導因子1α（HIF-1α）、葡萄糖轉(zhuǎn)運子1（GLUT-1）、脂聯(lián)素和瘦素基因表達。結(jié)果：與常氧組相比，缺氧12、24、48 h組HIF-1α、GLUT-1mRNA表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。缺氧24 h時HIF-1α、GLUT-1mRNA達到最高。各缺氧組脂聯(lián)素mRNA在12、24、48、72 h缺氧組的表達下降，較常氧組有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。各缺氧組瘦素mRNA的表達高于常氧組，并在24 h時達到最高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論：缺氧使脂肪細胞HIF-1α、GLUT-1、瘦素mRNA表達升高，脂聯(lián)素mRNA表達下降，各反應在缺氧24 h時達到最大水平。

脂肪細胞；缺氧誘導因子1α；葡萄糖轉(zhuǎn)運子1；缺氧；脂聯(lián)素；瘦素；肥胖；胰島素抵抗

Effectof incubation timeof hypoxia on theexpression of adipokines in the3T3-L1 adipocytes

YANGChuan-hui1,LIPing1,HEQing1,LIU Jin-quan2,NIUWen-yan2

(1.Department of Endocrinology,General Hospital,Tianjin Medical University,Tianjin 300052,China;2.Department of Immunology, Tianjin MedicalUniversity,Tianjin 300070,China)

Objective：To explore the effect of different incubation time of hypoxia on the expression of adipokines in the 3T3-L1 adipocytes.Methods:Thedifferentiated 3T3-L1 adipocyteswere randomly divided into6 groups,normoxia（21%O2）and hypoxia（1%O2）conditions for 4,12,24,48,72 h respectively.ThemRNA expressions of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α),glucose transporter 1 (GLUT-1),adiponectin and leptinwere detected by the qRT-PCR.Results:In 3T3-L1 adipocytes,themRNA expressionsofHIF-1αand GLUT-1 inhypoxia conditions for12 h,24h and 48 hwerehigher than normoxia-treated cells(P＜0.05);furthermore,theywerehighestin thegroup ofhypoxia-treated cells for24 h.Comparedwith thenormoxiagroup,theadiponectinmRNA expressionsof the hypoxia-treated 3T3-L1 adipocytesdecreased inallgroups(P＜0.05)except for the4h group(P＜0.05).Ttranscription levelof leptin in thehypoxia-treated cellsincreased(P＜0.05),and itreached thehighest level in the24 h hypoxiagroup.Conclusion:ThemRNA expressionsofHIF-1α,GLUT-1 and leptin of3T3-L1 adipocytes increase in the condition ofhypoxia incubation,while the levelofadiponectinmRNA decreases under hypoxia treatment.Allchangesabove reach thepeaks within the24hof hypoxia-treated 3T3-L1 adipocytes.

adipocytes;hypoxia inducible factor-1α;glucose transporter1;hypoxia;adiponectin;leptin;obesity;insulin resistance

R589.2

A

1006－8147（2015）01-0001-05

國家自然科學基金資助項目（81170740,81270144）；天津市科委科技支撐項目（09ZCZDSF04500）

楊傳慧(1988-)，女，碩士在讀，研究方向：內(nèi)分泌與代謝；

何慶，E-mail：hech69@hotmail.com。