文 / 關曉艷，師希雄，文鵬程，汪月，張忠明，張衛(wèi)兵

（甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院 甘肅蘭州，730070）

米黑毛霉產(chǎn)凝乳酶發(fā)酵條件研究

文 / 關曉艷，師希雄，文鵬程，汪月，張忠明，張衛(wèi)兵

（甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院 甘肅蘭州，730070）

為了進一步提高米黑毛霉發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的活力，采用單因素和正交試驗設計，對影響米黑毛霉產(chǎn)凝乳酶活力的起始pH、溫度、接種量及發(fā)酵時間等主要因素進行了優(yōu)化。結(jié)果表明: 溫度對米黑毛霉產(chǎn)凝乳酶活力影響最大，其次是接種量，發(fā)酵時間，起始pH 的影響較小。單因素和正交試驗結(jié)果確定的最佳發(fā)酵條件為: 在250mL三角瓶中裝發(fā)酵培養(yǎng)基（10g麩皮，10g營養(yǎng)液），溫度為32℃，發(fā)酵時間為120h，接種量為4mL，起始pH為5，凝乳酶活力可達1682.37SU/mL。

米黑毛霉; 凝乳酶; 發(fā)酵條件

凝乳酶是奶酪生產(chǎn)過程中使牛奶凝固的關鍵性酶[1-3]。傳統(tǒng)干酪生產(chǎn)中應用的凝乳酶是來自于小牛第四胃粘膜，但隨著世界乳酪產(chǎn)業(yè)不斷快速發(fā)展不斷壯大，單純靠宰殺犢牛來獲得凝乳酶不僅成本較高而且不能滿足乳制品行業(yè)快速發(fā)展的要求[3-6]。與傳統(tǒng)干酪生產(chǎn)中應用的皺胃酶相比，微生物凝乳酶的生產(chǎn)時間短，產(chǎn)量高，受氣候、地域、時間等因素的影響較小，用微生物產(chǎn)凝乳酶可以降低其生產(chǎn)成本[7-9]，所以微生物凝乳酶成為凝乳酶研究的熱點[10-12]。

本試驗以米黑毛霉作為研究對象，研究不同起始pH、溫度、接種量和發(fā)酵時間等對凝乳酶活力的影響，旨在篩選米黑毛霉產(chǎn)凝乳酶的最佳培養(yǎng)條件，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。

1、材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌種

米黑毛霉菌株HL-1: 甘肅省功能乳品工程實驗室保藏。

1.1.2主要培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH自然。先將馬鈴薯去皮、洗凈、切成小塊，稱取200g加入1L蒸餾水，煮沸20min，用紗布過濾，濾液用蒸餾水補至1L，再加入20g瓊脂，121℃滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：將麩皮與營養(yǎng)液按1:1(w/v)的比例混合，攪拌均勻，在121℃，0.15MPa下滅菌20min。營養(yǎng)液用葡萄糖2.5%(w/w)，乳清粉2.0%(w/w)配制，硝酸銨1.0%(w/w)，pH自然。

1.1.3主要儀器

HH-SZ65型數(shù)顯恒溫水浴鍋，北京醫(yī)療設備廠；YZ-280型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器械有限公司；HZQ-X100型振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；SW-CJ-ZFD型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；PHS-3C型數(shù)顯酸度計，上海精密科學儀器有限公司；MICRO17TR冷凍高速離心機。

1.2 方法

1.2.1菌株的活化

將米黑毛霉菌株接種于斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)4~5d，待長滿黑色孢子后待用。

1.2.2孢子懸浮液的制備

向生長良好的試管斜面種子中加入10mL的無菌生理鹽水，刮下孢子，移入裝有玻璃珠三角瓶中振蕩，在搖床上振蕩打散，再用帶脫脂棉的漏斗進行過濾，并調(diào)整孢子數(shù)為106個/mL。

1.2.3粗酶液的制備

將1mL米黑毛霉種子液接入到發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃的恒溫培養(yǎng)3d。培養(yǎng)完成后，加入100mL的蒸餾水，20℃、180r/min振蕩浸提1h，浸提液用四層紗布過濾，濾液于8000r/min離心15min，上清液即為粗酶液[13]。

1.2.4凝乳酶活力的測定

采用Arima法[14]。用0.01mol/L的CaCl2溶液溶配制10%的脫脂奶粉液，在室溫下放置40min后使用，取5mL10%的脫脂奶粉液在35°C下保溫10min，加入0.5mL在35°C保溫的粗酶液，迅速混合均勻，準確記錄從加入酶液到乳凝固的時間(s)。在上述條件下，把40min凝固1mL100g/L脫脂乳的酶量定義為一個索氏單位（Soxhlet Unit）。

式中，t為凝乳時間，D為稀釋倍數(shù)。

1.2.5起始pH對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

分別選取不同的初始pH值條件：4.5、5.0、5.5、6.0，以1mL的接種量接種至固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，其他條件固定不變，進行發(fā)酵培養(yǎng)，28℃培養(yǎng)3d后收集菌體并處理后，測定凝乳酶活力。

1.2.6溫度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

分別設定發(fā)酵溫度為28℃、30℃、32℃、34℃、36℃，以1mL的接種量接種至固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，其他條件固定不變，進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)3d后收集菌體并處理后，測定凝乳酶活力。

1.2.7接種量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

以接種量分別為1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL接種至固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，其他條件固定不變，28℃進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)3d后收集菌體并處理后，測定凝乳酶活力。

1.2.8發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響

分別設定發(fā)酵時間為84h、96h、108h、120h、132h，以1mL的接種量接種至固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，其他條件固定不變，28℃進行發(fā)酵培養(yǎng)，收集菌體并處理后，測定凝乳酶的活力。

1.2.9正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇起始pH、溫度、接種量和發(fā)酵時間進行四因素三水平正交試驗。

2、結(jié)果與分析

2.1起始pH對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖1 起始pH對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.1 The effect of initial pH on the MCA

初始pH會對微生物的生長產(chǎn)生影響從而影響發(fā)酵產(chǎn)物中目標酶的生成和累積[15]。由圖1可見，低酸性的培養(yǎng)環(huán)境更加有利于米黑毛霉的生長和代謝產(chǎn)酶，但是pH過高或過低都會降低發(fā)酵產(chǎn)物中凝乳酶的產(chǎn)生和累積。當起始pH為4.5~5.5時，凝乳酶活力隨pH升高而明顯升高，當起始pH達到5.5時酶活力達最大值566.93 SU/mL，起始pH為5.5以上時，凝乳酶活力隨起始pH的升高有明顯下降。

2.2溫度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖2 溫度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.2 The effect of temperature on the MCA

溫度是微生物生長的重要環(huán)境條件之一，在發(fā)酵過程中，選擇最適發(fā)酵溫度并不單單是選擇微生物生長傳代速度最快的溫度，而是積累所需發(fā)酵代謝產(chǎn)物的最佳溫度[15]。由圖2可見，當發(fā)酵溫度在28～30℃內(nèi)，凝乳酶的活力隨發(fā)酵溫度的升高迅速增長；當發(fā)酵溫度為30℃時，酶活力達到最大值1500.27SU/mL，溫度逐漸升高后，酶活力逐漸降低，隨溫度的升高，降低速率逐漸變慢。

2.3接種量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖3 接種量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.3 The effect of inoculums size on the MCA

接種量直接關系到各時間段單位體積培養(yǎng)基中微生物數(shù)量的多少，接種量過小則發(fā)酵時間延長，接種量過大則導致培養(yǎng)基營養(yǎng)供給影響產(chǎn)酶[15]。由圖3可見，接種量過低將延長菌體的延滯期，導致菌體的生長減慢，發(fā)酵時間延長，當在發(fā)酵培養(yǎng)基（10g麩皮，10g營養(yǎng)液）內(nèi)接種量為1~6mL內(nèi)，凝乳酶的活力隨接種量的增大逐漸增大，增大速率由慢變快，當接種量達到6mL時，酶活力達到最大值1437.16SU/mL，當接種量大于6mL時，酶活力逐漸降低，但隨接種量的升高，降低速率逐漸變慢，分析原因是此時培養(yǎng)基的營養(yǎng)已經(jīng)不能滿足微生物的生長需求，微生物之間開始競爭營養(yǎng)物質(zhì)，影響發(fā)酵產(chǎn)酶，當競爭越厲害，產(chǎn)酶量越少酶活越低。

2.4發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖4 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響Fig.4 The effect of fermentation time on the MCA

在不同的生長階段，微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的需求以及進行次級代謝的途徑都會有所不同[15]。由圖4可見，在發(fā)酵前期（108h以前）隨著發(fā)酵時間的延長，產(chǎn)物中凝乳酶的活性明顯呈上升趨勢，在發(fā)酵后期（120h以后）隨著發(fā)酵時間的延長，產(chǎn)物中凝乳酶的活性反而開始下降，分析的原因是培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分已經(jīng)不足以滿足生長需要，生長進入衰亡期。當發(fā)酵時間在84～120h內(nèi)，凝乳酶的活力隨發(fā)酵時間的延長迅速增長，但增加速率逐漸變慢；當發(fā)酵進行到108～120h時，凝乳酶活力達到較大值，120h酶活力達到1555.66SU/mL，120h后，酶活力逐漸降低。

2.5正交試驗

在單因素試驗的基礎上，通過四因素三水平正交試驗考察起始pH、溫度、接種量及發(fā)酵時間對產(chǎn)酶量的綜合影響。正交試驗因素水平表見表1，正交試驗結(jié)果分見表2。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 The result analyses of orthogonal experiment

對表2的試驗結(jié)果進行極差分析，結(jié)果表明四個因素對凝乳酶活力的影響為溫度＞接種量＞發(fā)酵時間＞起始pH。在試驗因子水平范圍內(nèi)，產(chǎn)酶量最高的組合是A1B3C1D3，即起始pH為5，溫度為32℃，接種量為4mL，發(fā)酵時間為120h。

為檢驗正交試驗結(jié)果的可靠性，將產(chǎn)酶量最高的組合A1B3C1D3進行3次平行試驗，測得的平均酶活為1693.52SU/mL，驗證試驗的酶活與正交試驗中的最優(yōu)組合A1B3C1D3對應的酶活（1682.37SU/mL）相對誤差為0.7%，說明試驗的結(jié)果是可靠的。

4、結(jié)論

通過單因素試驗，初步確定了有利于米黑毛霉產(chǎn)凝乳酶的起始pH、溫度、接種量和發(fā)酵時間的最優(yōu)值及最優(yōu)范圍。在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗對發(fā)酵條件進一步優(yōu)化，通過正交試驗可以看出，4個因子對產(chǎn)酶的影響作用由大到小依次為溫度、接種量、發(fā)酵時間、起始pH。最終確定的最佳培養(yǎng)條件為：溫度為32℃，接種量為4mL，發(fā)酵時間為120h，起始pH為5。

[1]李建濤,陳歷俊,姜鐵民.解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].中國食品添加劑,2012(1): 55-60.

[2]El-Bendary M A, Maysa E M,Thanaa H A. Purification and characterization of milk clotting enzyme produced by Bacillus sphaericus[J].Journal of Applied Sciences Research, 2007,3(8): 695-699.

[3] S.Seker,H.Beyenal ,A.TanyolaC .Modeling milk clotting activity in the continuous production of microbial rennet from Mucor miehei[J].Journal of Food Science,1999,64(3):525-529.

[4]孫海蛟,呂敏,黃艾祥.我國干酪凝乳酶研究及應用現(xiàn)狀[J].乳品加工,2008,5:50-53.

[5]張超壘,張志國,張玲梅,等.微生物發(fā)酵凝乳酶的探討[J].試驗研究,2011,(1):73-74.

[6]高維東,甘伯中,紀銀莉,等.微生物凝乳酶的研究進展[J].中國乳品工業(yè).2009,5:34-36.

[7]朱仁俊,石振興,甘伯中,等.凝乳酶的研究進展[J],中國乳業(yè)工業(yè),2009,38 (1):34-42

[8]劉彤,崔艷華,張?zhí)m威,等.凝乳酶的研究進展[J],中國乳業(yè)工業(yè),2011,38 (1):40-43

[9]劉顯庭,張昊,郭慧媛,等.凝乳酶在干酪生中的應用[J].中國乳業(yè),2013(133):54-57.

[10]孫健,宋曉紅.總狀毛霉凝乳酶的研制及初步應用[J].微生物學通報,1994,21(1):5-10.

[11]矯慶華,錢世鈞.微小毛霉凝乳酶的生物合成和性質(zhì)的研究[J].微生物學報,1992,32 (1): 30-35.

[12]吳進菊,徐爾尼,張鳳英,等.中國曲中凝乳酶高產(chǎn)菌株的篩選及產(chǎn)酶條件的研究[J].中國食品學報, 2009, 9(1):124-129.

[13]李學朋,梁琪,張衛(wèi)兵等,米黑毛霉產(chǎn)凝乳酶固體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2012,23:192-197.

[14]Arima K, Iwasake K. Milk-clotting enzyme from microorganisms. Part I Screening test and the identification of the potent fungus[J]. Agricultural Biological Chemistry,1967,31(5):540-545.

[15]廖亮.凝乳酶高產(chǎn)菌株的誘變選育及其發(fā)酵條件、產(chǎn)物酶學活性的相關研究[D].北京：北京化工大學,2010:50-57.

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術專項(GNCX-2014-31)；甘肅農(nóng)業(yè)大學SRTP項目(20141031)