本刊記者　徐芳芳

倪挺：探索基因調(diào)控之復雜

本刊記者徐芳芳

基因在肉眼看不到的世界里演繹著生命的繁衍、細胞分裂和蛋白質(zhì)合成等重要生理過程，100多年來，科學家們通過解讀基因儲存的生命遺傳信息，逐漸揭開了人類生命活動基本過程的面紗。

專家簡介：

倪挺，1977年生于江蘇省啟東市，復旦大學生命科學學院教授、博士生導師。主要借助高通量測序技術及現(xiàn)代分子生物學等手段研究真核生物轉(zhuǎn)錄組的復雜性以及細胞衰老基因表達調(diào)控的分子機制。在Nature、Nature Methods、PNAS、PLoS Pathogens、Scientific Reports等國際期刊發(fā)表20余篇研究論文，獲7項授權中國專利。入選中組部第三批“青年千人”計劃和上海市“浦江人才計劃”。擔任國家科技部“973計劃”課題負責人和科技部重大科學研究計劃研究骨干，主持兩項國家自然科學基金面上項目，是國家自然科學基金委創(chuàng)新研究群體的研究骨干。

從1909年丹麥遺傳學家約翰遜在《精密遺傳學原理》一書中正式提出“基因”概念，以此來替代孟德爾假定的“遺傳因子”?！盎颉币辉~便伴隨著遺傳學發(fā)展至今。

在神奇的生命世界里，科學家們尋找到這樣一條所有細胞結構生物都遵循的“中心法則”，即遺傳信息通過轉(zhuǎn)錄從DNA（脫氧核糖核酸）到RNA（核糖核酸），再通過翻譯從RNA到蛋白質(zhì)。

圍繞這一“中心法則”，許多科學家對生命體的各個環(huán)節(jié)進行了深入的探尋，復旦大學生命科學學院倪挺研究員就是其中一員。近年來，倪挺因在基因表達最重要的調(diào)控手段之一——中心法則中的“轉(zhuǎn)錄”和衰老相關疾病的轉(zhuǎn)錄組復雜性等方面有了新的進展，在國際上受到了廣泛認可。

生命科學之“夢”

“通過揭示和研究真核生物轉(zhuǎn)錄組的多樣性，了解高等生物基因調(diào)控網(wǎng)絡，并為深入理解人類疾病的復雜性提供理論依據(jù)?！边@是倪挺從事生命科學研究以來一直堅持的夢想。朝著這一目標，他用自己對生命科學的熱情一路求索、追尋，留下了精彩的足跡。

愛因斯坦說，興趣是最好的老師。倪挺也說：“他和基因?qū)W有緣?！睆男∷蛯ι澜绯錆M了好奇，探索和求知的欲望使他慢慢推開了生命科學的大門。那時的他還不知道，門外，就是他的夢想。

1996年，倪挺以優(yōu)異的成績考入北京大學生命科學學院生物化學及分子生物學系。未名湖畔，博雅塔下，恰同學少年，風華正茂，在濃厚的學習氛圍的熏陶下，他開啟了生命科學之旅。從生物化學及分子生物學系學士學位到碩博連讀植物學博士學位，10年的寒窗苦讀，執(zhí)著于夢想的他從未在探索生命科學領域的道路上停止過。

在生命科學植物分子生物學研究領域耕耘的林忠平教授的耐心指導下，倪挺對生命科學的理解逐漸由表及里，由淺入深。除了逐漸牢固生物研究基礎知識之外，他開始在研究方法、研究手段上有所精進，形成了自有的研究哲學和風格。

在碩博連讀期間，他就建立了中國第一個食物及花粉過敏原數(shù)據(jù)庫（http://ambl.pku.edu.cn），被農(nóng)業(yè)部指定為轉(zhuǎn)基因食品安全過敏性評估專業(yè)機構，獲得了北京大學最具份量的創(chuàng)新獎。同時，他還利用轉(zhuǎn)基因技術獲得了高表達小胰島素原類似物的轉(zhuǎn)基因靈芝，并證實口服轉(zhuǎn)基因靈芝可以顯著降低實驗動物的高血糖，研究成果對于口服胰島素的應用具有重要意義。

“科學探索永無止盡”，對倪挺來說更是如此。在北京大學博士畢業(yè)以后，他懷抱進一步深造的夢想，馬不停蹄地跨出國門，開啟了學術研究上的另一段重要征程。2007年～2010年進入美國杜克大學基因組科學與政策研究所在朱鈞教授實驗室從事博士后研究，2010年～2012年在美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）擔任助理研究員。

5年的海外漂泊使倪挺有機會領略了國際最前沿的科研理念，煉就了洞察生命科學國際走向的“火眼金睛”。2012年，在國家緊缺創(chuàng)新型人才的時候，“羽翼豐滿”的倪挺借第三批“青年千人計劃”的“東風”回到了祖國，受聘為復旦大學生命科學學院研究員。

“我們要把人生變成一個科學的夢，然后，再把夢變成現(xiàn)實?！本永锓蛉苏f過的這句話用來形容倪挺再適用不過，他也希望有“夢照現(xiàn)實”的一天。不管前面的路是平坦還是布滿荊棘，只要選擇了遠方，便只顧風雨兼程。正因為對生命科學的這份熱情與執(zhí)著，他收獲了科研上的累累碩果。

三項技術探秘基因表達調(diào)控

隨著高通量測序技術的飛速發(fā)展，人們對于轉(zhuǎn)錄組的認識也不斷加深，許多新的剪接異構體、非編碼RNA以及新的調(diào)控方式不斷被發(fā)現(xiàn)，組成了一個神奇的RNA世界，也成為了一個新興的熱門領域。

在朱鈞博士實驗室，倪挺就接受了嚴格的現(xiàn)代分子生物學、細胞生物學以及基因組實驗技術的訓練，并且發(fā)展了新的多個基因組及轉(zhuǎn)錄組測序方法。他采用“分子條形碼技術”，使得新一代測序技術中最具挑戰(zhàn)性的序列較短的問題得以解決。該方法同時還能應用于白血病相關致病基因的早期低豐度突變的靈敏檢測，目前，已申請了美國發(fā)明專利。

轉(zhuǎn)錄是基因表達關鍵的第一步。倪挺針對轉(zhuǎn)錄的三個環(huán)節(jié)，開發(fā)了三種新的高通量測序方法，這三項成果成為其研究生涯中的三大亮點。

針對轉(zhuǎn)錄起始環(huán)節(jié)，倪挺開發(fā)了雙端測序方法，并首次在果蠅中發(fā)現(xiàn)三種轉(zhuǎn)錄起始模式，建立了其與啟動子核心元件及表觀遺傳標記的關聯(lián)性，從而豐富了對轉(zhuǎn)錄起始模式的認識。該技術同時為mRNA重新加帽（recapping）這一新現(xiàn)象提供了最為有力的證據(jù)，證明其廣泛存在于轉(zhuǎn)錄組中。由于這一工作的重要性，Nature Reviews Genetics在論述轉(zhuǎn)錄組復雜性時還特別引用了他們的這一發(fā)現(xiàn)。

雙端測序確定轉(zhuǎn)錄起始位點的方法發(fā)表于《Nature Methods》并被列為封面推薦。《Nature Methods》還以NEWS and VIEWS形式對倪挺的方法以及稍后時間發(fā)表的另一個相關方法進行了深度評述，并認為他們建立的方法極大地促進了轉(zhuǎn)錄起始位點研究。

隨后，《Nature Reviews Genetics》 RNA富集在減數(shù)分裂和對環(huán)境脅迫應答的基因中，從而拓展了反義RNA新的生物學功能，豐富了人們對于真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控復雜性的認識。

這是首次在單細胞生物中發(fā)現(xiàn)反義RNA參與了減數(shù)分裂這一與酵母生殖密切相關的重要過程。這一重要發(fā)現(xiàn)被隨后的Science封面文章多次引用并加以證實。同時，該方法已被國內(nèi)外10多個實驗室采用并取得了很有意思的發(fā)現(xiàn)。

針對轉(zhuǎn)錄終止環(huán)節(jié)過程，倪挺建立了多聚腺苷酸精確定位測序方法（PA-seq）。這一方法的建立完善了對于轉(zhuǎn)錄過程從頭到尾的研究，為研究選擇性將他的這個方法作為RNA測序領域的一種重要方法給予介紹。論文同時被“基因組在線”這個在基因組研究領域具有重要影響力的網(wǎng)站在This week in Nature專欄中作為Nature Methods的唯一入選論文加以報道。這一方法同時也被介紹下一代測序技術的專著引用。關于轉(zhuǎn)錄起始模式和表觀遺傳學標記關聯(lián)的發(fā)現(xiàn)也被Nature Reviews Genetics作為重要文獻引用。

為了更好地從全基因組水平研究轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控，倪挺開發(fā)了定向連接介導的鏈特異性RNA-seq方法。利用這個方法，他首次在裂殖酵母中發(fā)現(xiàn)反義多聚腺苷酸化在基因調(diào)控中的重要作用提供了技術支撐。利用這個方法，他們測定了多個人體組織的polyA加尾位點，并取得了兩個很有意思的發(fā)現(xiàn)。其一，選擇性polyA加尾不僅在編碼基因中存在，在非編碼基因中也廣泛存在；其二，發(fā)現(xiàn)了一組對人組織特異性具有調(diào)控作用的選擇性Poly（A）新位點。

三項技術成果的組合使用對于全面理解和揭示真核生物轉(zhuǎn)錄組的復雜性，了解高等生物基因調(diào)控奠定了方法學基礎，為深入理解人類疾病的復雜性提供了全新手段。

研發(fā)線粒體DNA低頻突變深度測序方法

近10年來，衰老相關疾病顯著增加，而且一些疾病逐漸呈年輕化發(fā)展。衰老是一個漸進的緩慢過程，其必然包括某些基因成千上萬個拷貝的漸進性序列改變，而哺乳動物細胞中，只有線粒體這個遺傳系統(tǒng)有上千拷貝，從0～100％漸進的遺傳變異。

線粒體DNA（mtDNA）是母系遺傳，并有較大的遺傳變異，這些遺傳變異是使得人類能夠適應環(huán)境改變的一個重要因素。每個細胞含有百計的線粒體和千計的線粒體DNA（mtDNA），研究表明，線粒體功能衰退和mtDNA的損傷被認為在衰老及其相關疾病中起著重要的作用，也和諸多疾病，如耳聾、心臟病、腎病等退行性疾病有關系。近幾十年來，研究者們提出各種衰老假說，并不斷聚焦于線粒體。隨著mtDNA分子生物學研究的深入，mtDNA在疾病中的作用逐漸為人們所重視。

在以前的研究中，由于檢測技術的限制，多數(shù)研究關注與mtDNA的缺失突變和高頻點突變導致的生物學后果，而對低頻點突變導致衰老及相關疾病的研究不足，特別是總體而言，mtDNA突變到什么程度才能引起衰老更是知之寥寥。

回答mtDNA突變（特別是低頻點突變）與衰老研究中的未解之謎，可靠測定線粒體低頻點突變的技術是前提。隨著高通量測序技術的飛速發(fā)展，測序的深度和覆蓋度不斷加深，使得之前所不能實現(xiàn)的低頻點突變檢測有了可能。

然而，近幾年出現(xiàn)的基于深度測序來測定線粒體突變的方法都存在一定的局限性：從細胞中分離線粒體，再提取線粒體DNA并構建文庫進行深度測序的方法涉及到線粒體的分離，操作復雜繁瑣，工作量大；基于聚合酶鏈式反應（PCR）擴增的深度測序方法覆蓋度均一性較差，易于引入低頻突變，干擾真正低頻突變的檢測；序列捕獲方法不能有效區(qū)分來自核基因組的線粒體假基因。

為了克服以上方法的缺點，倪挺及其科研團隊研發(fā)出了一種更簡單、更高效的線粒體DNA低頻突變深度測序方法。這種方法通過設計一組線粒體DNA特異的引物，采用滾環(huán)復制（RCA）從總DNA中富集線粒體DNA，并通過特定的限制性內(nèi)切酶進一步富集線粒體DNA，然后構建測序文庫并進行高通量測序，并開發(fā)特定的數(shù)據(jù)分析流程，從而達到測定線粒體基因組中低頻率變異的目的。

RCA比PCR保真性大大增強，酶切過程克服了核基因組線粒體假基因的干擾。這兩方面的優(yōu)勢使得倪挺研發(fā)的新技術能夠可靠檢測低至0.3％的mtDNA低頻點突變。這一精度足夠倪挺所在的科研團隊檢測頻率＜2％的點突變，因此突破了技術限制，為解決mtDNA低頻突變與衰老研究之間的關系提供了新的可能。

基于這一檢測方法，倪挺及團隊在線粒體DNA聚合酶g（Polg）基因突變導致mtDNA復制修復功能缺失的小鼠中進行了驗證，發(fā)現(xiàn)突變小鼠的mtDNA低頻點突變顯著高于野生型小鼠，并發(fā)現(xiàn)不同組織具有不同數(shù)目的低頻點突變，mtDNA聚合酶（Plog）基因突變導致早衰的小鼠中mtDNA突變水平的升高主要是由于低頻點突變的位點數(shù)目增加，而已有突變位點的頻率增加則居次要地位。更有意思的是，Polg基因突變小鼠中有更多的胞嘧啶（C）變成胸腺嘧啶（T），使得更多親水氨基酸變成疏水性，提示低頻點突變的累積可能是導致早衰表型的原因。

在科研的不斷深入的同時，倪挺帶領科研團隊申請到了國家自然科學基金面上項目，在接下來的研究中，他將以“線粒體DNA低頻點突變在衰老中的影響及機制”為研究重點，利用自主開發(fā)的線粒體DNA低頻點突變檢測新方法，以具有早衰表型的小鼠和正常衰老的小鼠為研究對象，結合最新的基因編輯技術（實現(xiàn)基因定點突變）、鏈特異性RNA-seq技術（研究線粒體DNA低頻點突變的基因表達）以及其他必要的分子生物學手段，闡明線粒體DNA低頻點突變在不同衰老類型中隨衰老進程的變化規(guī)律以及mtDNA在不同組織具有不同突變頻率/速度的內(nèi)在機制。

目前，為了能夠深入研究這一課題，倪挺組織力量進一步加強實驗和生物信息學的結合，解讀線粒體基因及核基因組所攜帶的遺傳信息傳遞過程，探索生命這個復雜系統(tǒng)的奧秘。與此同時，他也一直在為煉就一支精于科研的團隊，為生命科學培養(yǎng)出更多的精英，研發(fā)新技術而忙碌。

對于未來的規(guī)劃，倪挺心中已再清晰不過了。站在黃浦江畔，立身于復旦這所在學術研究上享譽全球的巍巍大學，倪挺用科研成果詮釋著自己對生命科學的熱情與執(zhí)著。