陽 磊汪開毓周 燕王二龍王 均陳德芳耿 毅賴為民

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚病研究中心, 成都 611130; 2. 四川省廣元市農(nóng)業(yè)局, 廣元 628017)

魯氏耶爾森氏菌口服微球疫苗特性分析及免疫效果研究

陽 磊1 , 2汪開毓1周 燕1王二龍1王 均1陳德芳1耿 毅1賴為民1

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚病研究中心, 成都 611130; 2. 四川省廣元市農(nóng)業(yè)局, 廣元 628017)

為制備并評價魯氏耶爾森氏菌口服微球疫苗的免疫效果, 實驗采用天然高分子聚合物海藻酸鈉為疫苗載體, 魯氏耶爾森氏菌滅活疫苗為抗原, 制備魯氏耶爾森氏菌口服疫苗。以拌料口服方式進(jìn)行免疫, 通過血清非特異免疫指標(biāo)、抗體效價、免疫保護(hù)率等綜合評價疫苗的免疫效果。結(jié)果表明, 魯氏耶爾森氏菌口服微球疫苗成球性好, 粒徑均勻, 粒徑(8.76±1.73) μm, 跨距0.47, 包封效率94.51%, 具備良好的抗酸性、腸溶性及高安全性的特點。將疫苗免疫斑點叉尾

魯氏耶爾森氏菌; 口服疫苗; 非特異性免疫功能; 免疫保護(hù)

魯氏耶爾森氏菌(Yersinia ruckeri)為腸桿菌科(Enterobacteriaceae)耶爾森氏菌屬(Yersinia), 革蘭氏陰性短桿菌, 該菌主要引起鮭鱒類(尤其是虹鱒)發(fā)生紅嘴病, 也稱腸炎紅嘴病(Entericredmouth, ERM)[1], 1999年Danley等[2]首次報道該菌可感染斑點叉尾并引起嚴(yán)重死亡。近年來, 該病已逐漸成為危害斑點叉尾

(Ictalurus punctatus)健康養(yǎng)殖的重要疾病。長期以來, 對于水產(chǎn)動物細(xì)菌病的防控主要采用抗生素和化學(xué)藥物, 但也帶了細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生、食品安全、藥物殘留等諸多問題, 作為最為有效的疾病防控方式, 疫苗的使用勢在必行[3—5]。漁用疫苗免疫方式主要分為注射、浸泡和口服 3種, 其中口服疫苗因其操作方便、應(yīng)激小、成本低以及可對各階段魚類進(jìn)行免疫的優(yōu)點而備受關(guān)注。但是口服疫苗免疫效果易受胃腸環(huán)境影響[6], 這嚴(yán)重制約了口服疫苗的發(fā)展。目前, 為解決這一問題, 較多學(xué)者利用多種材料作為口服疫苗載體, 開發(fā)口服疫苗傳遞系統(tǒng), 并取得了較多的成績[7—11]。魚類屬于低等脊椎動物, 特異性免疫系統(tǒng)尚不健全, 非特異性免疫在魚類免疫防御中起著重要作用, 可分為細(xì)胞免疫和體液免疫[8], 對于非特異性免疫能力的評價, 主要以超氧化物歧化酶活性、溶菌酶活力、ACH50活性等作為主要評價指標(biāo)[12, 13]。本研究以海藻酸鈉為口服疫苗載體, 制備魯氏耶爾森氏菌口服微球疫苗, 并對疫苗的免疫效果進(jìn)行研究, 期望開發(fā)一種新的漁用口服疫苗, 為魚類口服疫苗研究提供更多的參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

致病性 Y. ruckeri由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚病研究中心自行分離保存, 實驗用健康斑點叉尾購自雅安某斑點叉尾養(yǎng)殖基地, 體質(zhì)量(50±5) g。

1.2 魯氏耶爾森氏菌滅活疫苗制備

將復(fù)壯后的Y. ruckeri接種于于LB液體培養(yǎng)基中, 28℃震蕩培養(yǎng)24h, 革蘭氏染色鏡檢驗純。生理鹽水調(diào)整菌液濃度為 3×109cfu/mL, 用錐形瓶分裝適量菌液加入終濃度為 0.30%的福爾馬林, 搖床120 r/min, 28℃滅活24h后, 用無菌生理鹽水洗滌3 次, 置于4℃冰箱備用。

1.3 魯氏耶爾森氏菌口服微球疫苗及疫苗飼料制備

參照陽磊等[14]采用響應(yīng)面法優(yōu)化后的制備工藝,制備Y. ruckeri口服微球疫苗以及海藻酸鈉空微球。

將Y. ruckeri微球疫苗、Y. ruckeri滅活疫苗以及海藻酸鈉空微球分別按所需免疫劑量與粉碎后的飼料混合再成型、干燥制成口服疫苗飼料, 按照體重的2%進(jìn)行投喂。

1.4 口服微球疫苗特性分析

微球疫苗形態(tài)及粒徑分析 取少量微球溶液于載玻片上, 于顯微成像系統(tǒng)下觀察并拍照, 隨機選取600個微球, 利用圖像分析軟件Image-pro-plus測量粒徑大小, SPSS軟件對粒徑進(jìn)行分析。粒徑分布用跨距表示, 計算公式為:

式中, D10, D50和D90分別指粒徑累積分布圖中10%、50%和90%處所對應(yīng)的粒徑。

包封效率測定 將制備的微球重懸, 取3 mL微球懸液離心, 將得到的微球加入到55 mmol/L檸檬酸鈉溶液中, 120 r/min搖床過夜, 充分溶解。再將溶液10000 r/min離心10min, 將所收集細(xì)菌用紫外分光光度計于600 nm處測定細(xì)菌OD值, 按照公式計算包封效率:

疫苗安全性檢驗 取少量微球疫苗涂布于BHI平板, 于28℃下培養(yǎng)48h, 觀察有無細(xì)菌生長。將40尾健康斑點叉尾分為4組, 每組10尾。

分別將制備好的微球疫苗以 1×109cfu/尾的濃度灌胃、腹腔注射接種, 設(shè)置無菌PBS灌胃、腹腔注射對照組, 觀察統(tǒng)計 14d內(nèi)接種魚的發(fā)病情況及存活率。

體外模擬釋放實驗 為了檢測微球疫苗在胃腸條件下的釋放情況, 參照Rodrigues等[6]以及Tian 等[11]的方法, 配置模擬胃液(pH 2.0的PBS溶液)及腸液(pH 9.0的Tris-HCl溶液)檢測微球疫苗的釋放率。

參照Leal等[15]的方法, 分別取適量制備好的微球疫苗分散于5 mL模擬胃液、模擬腸液中, 于22℃下先在模擬胃液中反應(yīng) 6h后再轉(zhuǎn)移至模擬腸液中繼續(xù)反應(yīng), 分別于1h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h和24h取上清液, 500 r/min離心1min, 用紫外分光光度計于600 nm處測定細(xì)菌的OD值, 重復(fù)測定3次取平均值, 根據(jù)公式計算微球疫苗的釋放率,并繪制釋放曲線。

1.5 免疫程序及樣品采集與處理

1.6 血清總超氧化物歧化酶(Total superoxide disumutase activity, T-SOD)活力檢測

利用 T-SOD試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)測定受免魚血清 T-SOD酶活力。按下列公式計算T-SOD活力:

表1 免疫程序Tab. 1 The immunization program

T-SOD活力(U/mL)=(對照管OD值–測定管OD 值)/(對照管OD值)/50%×反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù)×樣本測試前的稀釋倍數(shù)

1.7 血清溶菌酶活力檢測

血清溶菌酶活力測定, 利用凍干的微球菌粉通過濁度分析法進(jìn)行測定[8, 17]。

1.8 血清補體替代途徑活性(Alternative pathway

complement activity, ACH50)檢測

參照 Sitjà-Bobadilla 等[18]的方法測定血清中補體替代途徑活性。

1.9 微量凝集實驗檢測血清抗體水平

參照Huang等[19]方法, 向96孔板1—12孔中加入50 μL PBS, 再向第1孔中加入50 μL待測血清,吹打8—10次, 取50 μL加入第2孔, 依次倍比稀釋,至第10孔, 棄去50 μL, 末尾2孔不加血清作為抗原對照, 然后每孔中加入一定濃度的抗原50 μL, 同時設(shè)陽性、陰性對照, 混勻后反應(yīng), 過夜, 觀察記錄結(jié)果。

1.10 攻毒試驗及相對免疫保護(hù)效果測定

2 結(jié)果

2.1 微球疫苗形態(tài)及粒徑分析結(jié)果

本實驗制備的Y. ruckeri口服微球疫苗粒徑分布較集中, 微球成球性好(圖 1), 粒徑(8.76±1.73) μm,跨距0.47(圖2)。

2.2 疫苗安全性檢驗

將制備好的 Y. ruckeri口服疫苗和滅活疫苗涂布于LB平板, 各設(shè)3個重復(fù), 28℃條件下培養(yǎng)48h后觀察, 均無細(xì)菌生長。

將制備好的 Y. ruckeri口服疫苗以將制備好的微球疫苗以1×109cfu/尾灌胃、腹腔注射接種健康斑點叉尾, 設(shè)置無菌PBS腹腔注射對照組, 14d內(nèi)接種魚未見任何異常, 均無發(fā)病或死亡, 證明疫苗安全性良好。

圖1 魯氏耶爾森氏菌微球疫苗形態(tài)(1000×)Fig. 1 The shape of the microparticles vaccine of Y. ruckeri

圖2 魯氏耶爾森氏菌微球疫苗粒徑分布Fig. 2 The size distribution of the microparticles vaccine of Y. ruckeri

2.3 體外模擬釋放

本實驗制備的 Y. ruckeri口服疫苗在模擬胃液(pH 2.0)中, 釋放率極低, 24h內(nèi)釋放率僅為12.90%,在模擬腸液(pH 9.0)中時, 出現(xiàn)了起始的突釋現(xiàn)象(26.00%), 之后持續(xù)快速的釋放, 24h累積釋放率分別為89.00%(圖3)。

為更準(zhǔn)確地模擬疫苗口服后在魚類胃腸道中的釋放, 將微球首先在模擬胃液中處理 6h, 再轉(zhuǎn)移至模擬腸液中繼續(xù)處理, Y. ruckeri微球疫苗在模擬胃液中處理6h后轉(zhuǎn)移至模擬腸液中, 24h累積釋放率92.00%, 轉(zhuǎn)移至模擬胃液中18h累積釋放率87.90%,遠(yuǎn)高于僅在模擬腸液中處理的微球18h累積釋放率70.00% (圖3)。

圖3 在不同條件下魯氏耶爾森氏菌微球疫苗體外模擬釋放曲線Fig. 3 The release profile of microparticles vaccine of Y. ruckeri under different conditions in vitro

2.4 血清總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力檢測結(jié)果

在實驗中, 各免疫組血清T-SOD活力在前3周都極顯著高于對照組(P＜0.01), 但在第4周后, 僅有Y. ruckeri微球疫苗組血清T-SOD活力仍極顯著高于對照組(P＜0.01), 且持續(xù)到第7周時, 與對照組差異不顯著(P＞0.05)(圖4)。

2.5 血清溶菌酶活力檢測結(jié)果

在免疫后第1周Y. ruckeri滅活疫苗組血清溶菌酶活力高于微球疫苗組和空微球組, 第 2周時 Y. ruckeri微球疫苗組溶菌酶活力達(dá)到峰值, 之后開始下降, 但下降速度明顯慢于滅活疫苗及空微球組,至第7周時, 與對照組差異不顯著(P＞0.05), 而滅活苗組和空微球組分別于第6周和第5周時即與對照組差異不顯著(P＞0.05)。

圖4 斑點叉尾血清總超氧化物歧化酶活力變化Fig. 4 The difference in the activity of serum T-SOD of I. punctatus

圖5 斑點叉尾血清溶菌酶活力變化Fig. 5 The difference in the activity of serum lysozyme of I. Punctatus

2.6 血清補體替代途徑活性(ACH50)檢測結(jié)果

在免疫后第1、2周, 各實驗組ACH50活性均極顯著高于對照組(P＜0.01), 在第 2周達(dá)到峰值后, ACH50活性開始降低, Y. ruckeri微球疫苗組至第 6周時 ACH50活性仍極顯著高于對照組(P＜0.01), 滅活疫苗組在第 5周時與對照組差異不顯著(P＞0.05),空微球組僅第1、2周極顯著高于對照組(P＜0.01), 之后與對照組差異不顯著(P＞0.05)。

2.7 微量凝集實驗檢測血清抗體

通過微量凝集實驗檢測, Y. ruckeri微球疫苗組在第4周時檢測到特異性抗體, 效價1∶4, 第5周時達(dá)到峰值 1∶8, 之后抗體水平開始降低, 至第 8周時仍能檢測到低水平的特異性抗體。Y. ruckeri滅活疫苗組僅在第4周時檢測到特異性抗體, 效價1∶2?？瘴⑶蚪M和對照組在整個實驗中均無特異性抗體檢出。

2.8 相對免疫保護(hù)率

3 討論

圖6 斑點叉尾血清補體替代途徑活性變化Fig. 6 The difference in the activity of serum ACH50of I. punctatus

表2 攻毒后斑點叉尾死亡率和相對免疫保護(hù)率Tab. 2 The mortality and the relative survival rate of I. punctatus after the challenge with Y. ruckeri

表2 攻毒后斑點叉尾死亡率和相對免疫保護(hù)率Tab. 2 The mortality and the relative survival rate of I. punctatus after the challenge with Y. ruckeri

分組Groups數(shù)量(尾) Quantity (tail)死亡數(shù)量(尾)The amount of death (tail)死亡率Mortality (%)相對免疫保護(hù)率RPS (%) Y. ruckeri微球疫苗組 30 10 33.33 65.52 Y. ruckeri滅活疫苗組 30 25 83.33 13.80空微球組 30 26 86.67 10.34對照組 30 29 96.67 0.00

本研究以海藻酸鈉為載體材料, 制備Y. ruckeri口服微球疫苗, 得到的微球疫苗粒徑分布集中, 成球性好, 粒徑(8.76±1.73) μm, 跨距 0.47, 包封效率94.51%。相比采用單因素和正交優(yōu)化, 本實驗采用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝制備微球疫苗, 相比 Rodrigues 等[6]研究結(jié)果(包封效率 100%), 包封效率略低, 但微球粒徑相比Rodrigues等[6]、Romalde等[16]、李義等[9]有了較大的降低, 有研究顯示與哺乳動物相比,魚類免疫接種需要粒徑小于10 μm裝載大量抗原的微球疫苗[6], 粒徑小的微球疫苗更有利于魚類腸道后段對其吸收, 本實驗制備的Y. ruckeri口服疫苗粒徑小, 免疫斑點叉尾相對免疫保護(hù)率為 65.52%,高于曲向陽[20]制備的嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)口服疫苗[粒徑(11.01±0.15) μm], 保護(hù)率50.00%, 丁詩華等[21]制備的聚乳酸-乙醇酸共聚物[(poly(lactide-co-glycolide), PLG)]嗜水氣單胞菌口服疫苗(粒徑約10 μm), 但保護(hù)率僅為32.10%, 這可能與疫苗制備方法與載體材料不同有關(guān)。在體外模擬釋放試驗中, 微球疫苗在模擬胃液中僅有較低的釋放率(12.90%), 而在模擬腸液中釋放率高(89.00%),這與海藻酸鈉微球具有的低pH收縮, 高pH溶脹特性有關(guān)[22]。為更好的模擬微球疫苗在胃腸道種的釋放, 將微球疫苗先在模擬胃液中處理 6h, 再轉(zhuǎn)移至模擬腸液中處理可發(fā)現(xiàn)微球具有了更快的釋放速率,推測酸性條件下的孵育, 將有助于海藻酸鈉微球在堿性環(huán)境中的釋放, 這與Gombotz等[23]的研究結(jié)果相似。

魚類為低等脊椎動物, 非特異性免疫在魚類免疫系統(tǒng)中起著重要的作用。超氧化物歧化酶是魚類清除機體自由基的重要物質(zhì), 當(dāng) SOD活力下降時,機體消除自由基的能力減弱, 從而影響免疫功能;溶菌酶是一種堿性蛋白, 能水解細(xì)胞壁中的黏肽的乙酰氨基多糖并使之裂解釋放, 從而消除侵入機體的異物, 實現(xiàn)機體防御功能, 作為魚類非特異性免疫的重要組成, 其廣泛分布于血清、黏液及部分淋巴組織中, 魚體內(nèi)溶菌酶的活力和水平, 直接關(guān)系到魚類的免疫功能和健康[24]; 魚類補體直接參與機體防御, 其生物學(xué)活性影響機體抵抗微生物的能力、免疫復(fù)合物的形成和持續(xù)時間等, 而 ACH50是衡量魚類非特異性免疫力的一項重要指標(biāo)[25]; 在本實驗中免疫 Y. ruckeri口服微球疫苗的實驗組血清T-SOD活力、溶菌酶活力、ACH50活性均至第6周時仍極顯著高于對照組(P＜0.01), 說明免疫后的魚體內(nèi)能較長時間保持機體對自由基的清除能力, 對入侵病原菌的裂解并能有效的激活補體系統(tǒng)發(fā)揮免疫功能, 從而提高機體非特異性免疫能力; 同時,對血清中特異性抗體的檢測可知, 在第 4周時, 可檢測到特異性抗體, 至免疫后的第 8周仍有特異性抗體存在, 因此, 在整個實驗中非特異性免疫和特異性免疫的共同作用, 為魚體提供了更為長期有效的免疫保護(hù)。在本實驗中使用的疫苗載體材料海藻酸鈉, 是一種天然的高分子聚合物, 其具有的生物黏附性、低免疫原性、無刺激、生物無毒等優(yōu)點使其已較多的應(yīng)用于魚類疫苗開發(fā)[8, 11], 從本實驗結(jié)果可以看出, 免疫空微球的斑點叉尾非特異性免疫功能在短時間內(nèi)也得到了提高, 并能提供10.34%的免疫保護(hù)率, 這也表明海藻酸鈉具有一定的免疫增強作用。

本研究制備了魯氏耶爾森氏菌口服微球疫苗并對其免疫效果進(jìn)行研究, 證明該疫苗可對斑點叉尾提供較好的免疫保護(hù)。

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THE CHARACTERISTICS AND IMMUNE EFFICACY OF AN ORAL MICROSPHERES VACCINE OF YERSINIA RUCKERI

YANG Lei1,2, WANG Kai-Yu1, ZHOU Yan1, WANG Er-Long1, WANG Jun1, CHEN De-Fang1,
GENG Yi1and LAI Wei-Min1
(1. Fisheries Department of Sichuan Agricultureal University, Chengdu 611130, China; 2. Sichuan Guangyuan Agricultural Bureau, Guangyuan 628017, China)

Yersinia ruckeri is major pathogenic bacterium that is harmful to the aquaculture of Ictalurus punctatus. The conventional treatment such as antibiotics and chemicals often cause issues in, for example, food safety and drug resistance. The vaccine has been considered to be the most effective method of disease prevention and control. Currently, natural polymer materials have been used as the carrier for fish oral vaccine, and sodium alginate is regarded as an ideal material and has become a hotspot in research. In this study, we prepared the oral microspheres vaccine of Y. ruckeri by using formalin-inactivated Y. ruckeri as the antigen and sodium alginate as the carrier. We also studied the characteristics of this vaccine and evaluated its immune efficacy that was indicated by the serum non-specific immune parameters, the antibody titers and the relative survival rate. We found that the microspheres had a good form with a homogeneous distribution of the particle diameter; the average diameter was (8.76±1.73) μm and the span was 0.47; and the encapsulation efficiency of the vaccine was 94.51%. Moreover, this vaccine exhibited characteristics such as high acid resistance, good enteric solubility, and being safe. The activities of the serum lysozyme, the total superoxide disumutase (T-SOD) and the alternative pathway complement (ACH50) were significantly increased in the vaccinated I. punctatus. The serum agglutination titers reached the peak value of 1: 8 in the 5th week, and the specific antibodies were detected in the 8th week after vaccination. The relative survival rate of the I. punctatus was 65.52%. In conclusion, the oral microspheres vaccine of Y. ruckeri effectively protects the fish form the Y. ruckeri disease.

Yersinia ruckeri; Oral vaccine; Non-specific immunity function; Relative percent survival

S942.5

A

1000-3207(2015)06-1142-08

10.7541/2015.150

2015-02-10;

2015-06-18

教育部《長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊發(fā)展計劃》創(chuàng)新團(tuán)隊專項(IRT0848); 四川省科技廳產(chǎn)業(yè)鏈(2014NZ003); 四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)專項(2014JY0143)資助

陽磊(1989—), 男, 四川蒼溪人; 碩士研究生; 主要研究方向為水產(chǎn)動物疾病與免疫。E-mail: yangleigy@163.com

汪開毓(1955—), 教授, 博士生導(dǎo)師, E-mail: kywangsicau@126.com