常溫與高溫嗜油微生物的異同比較分析

李琳，羅明志，周遠群，徐文碩，張強，邱國華，鄧林紅*

(常州大學 生物醫(yī)學工程與健康科學研究院常州市呼吸醫(yī)學工程重點實驗室，江蘇 常州 213164)

摘要：石油污染的環(huán)境中存在可以降解石油烴的微生物.比較了高溫微生物(包括嗜油菌)和常溫微生物在菌體細胞的形態(tài)、結構、生理生化的性質(zhì)、DNA(基因組)和蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)組)等方面的異同，并總結了一些高溫微生物可能的適應機制，以期有助于進一步提高高溫嗜油菌的應用潛力.

關鍵詞：高溫微生物；常溫微生物；嗜油菌

中圖分類號：Q932文獻標志碼：A

文章編號：1008-5564(2015)03-0047-03

收稿日期：2015-02-03

基金項目：小麥精準量化栽培技術研究及示范推廣項目(NC1306)

作者簡介：張選厚(1964—)，男，陜西藍田人，陜西省西安市農(nóng)業(yè)技術推廣中心研究員，主要從事作物高產(chǎn)栽培技術研究與推廣.

ComparativeAnalysisonSimilaritiesandDifferencesofOilMicroorganismsatNormalandHighTemperature

LILin,LUOMing-zhi,ZHOUYuan-qun,XUWen-shuo,ZHANGQiang,QIUGuo-hua,DENGLin-hong

(ChangzhouKeyLaboratoryofRespiratoryMedicalEngineering,InstituteofBiomedicalEngineeringand

HealthSciencesofChangzhouUniversity,Changzhou213164,China)

Abstract：Microorganisms that can degrade petroleum hydrocarbons exist in the petroleum pollution environment.In this paper, similarities and differences of morphology, structure, physiological and biochemical properties, DNA (genome) and proteins (proteomics) of bacterial cells were compared for high temperature microorganisms (including oil bacteria) and normal temperature microorganisms, and some possible adaptation mechanisms of high temperature microorganisms were summarized to improve the potential application of oil bacteria at high temperature.

Keywords：hightemperaturemicroorganisms;normaltemperaturemicroorganisms;oilbacteria

石油微生物在石油開采和含油污水的處理領域具有重要意義[1].在石油開采方面，傳統(tǒng)的物理及化學采油方法缺點較多，如工藝復雜、成本高以及污染嚴重，特別是采收率低,僅60%～70%以上的原油在開采后仍殘留于油藏中無法開采，這些殘留的主要成分是重質(zhì)原油[2].嗜油菌可以使原油的組分和性質(zhì)發(fā)生變化(輕質(zhì)組分增加、粘度下降)，從而改善原油的流動性；嗜油菌還可以產(chǎn)生有機溶劑、表面活性劑、酸和氣體等驅(qū)油物質(zhì)，提高驅(qū)油效率，從而提高原油的采收率.

微生物也被廣泛用于含油污水的處理.在采油、煉油、貯油及運輸?shù)冗^程中產(chǎn)生大量含油污水，如果不加處理直接排入河流、湖泊或海灣，會對人類、動物和植物以及整個生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生嚴重危害，影響工業(yè)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和旅游業(yè)發(fā)展.尤其是石油中含有致癌烴，可被魚、貝富集并通過食物鏈危害人體健康[3].

目前，含油污水的處理方法很多，包括物理、化學和生物(如嗜油菌)等方法.其中嗜油菌方法費用低、效率高，而且所能處理的污染物閾值低、殘留少，被視為一項具有廣闊前景的高新技術，是目前環(huán)境科學研究的熱點[4].

在土壤和水體中存在著大量能夠降解石油烴類化合物的微生物[1,4]，目前已分離多個屬的細菌可利用原油或原油的某一組分為唯一碳源生長，特別是在受油污染的水和沉積物中(比未受污染地區(qū)高出1～2個數(shù)量級)，有70多個屬，140余種，包括細菌、放線菌、霉菌、酵母等，較為常見的有紅球菌屬[5]、假單胞菌屬[6]、不動桿菌屬[6]、無色桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、節(jié)桿菌屬、芽孢桿菌屬、黃桿菌屬、棒桿菌屬、微桿菌屬、微球菌屬、放線菌屬、諾卡氏菌屬、分枝桿菌屬等等；真菌有：曲霉屬、毛霉屬、鐮刀霉屬、青霉屬、木霉屬和被孢霉屬；酵母菌有假絲酵母屬、紅酵母屬、球擬酵母屬和酵母屬[7].

但這類常溫石油降解菌的最適溫度一般是15～50℃[8-9]，無法滿足更高溫度的要求，如沙漠土壤、半干旱的炎熱地區(qū)的油田和更深更熱的油井，以及高溫含油污水的處理等，因此很多學者開始研究降解石油的高溫菌，其最適溫度一般在50～80℃之間，有的甚至能達到100℃以上[9].高溫菌可以分離自火山島[10]、草堆、煤堆、溫泉、地熱區(qū)土壤以及高溫油田原油樣品和油層采出水[11].目前已報道的有嗜熱嗜油桿菌屬[12]、熱微菌屬、芽孢桿菌屬、地芽孢桿菌屬、棲熱菌屬、嗜熱古細菌、硫礦硫化葉菌、嗜熱細菌中的海棲熱袍菌等.目前，在石油污水處理中應用較多的是常溫嗜油菌，但在實際的處理過程中卻遇到了一些問題.比如在污水處理工藝中，原油經(jīng)過三相分離之后的含油污水溫度為50～60 ℃，所以要在用常溫微生物進一步降解之前，將含油污水進行降溫，這就消耗了大量的電能，同時會將污水中的芳香烴等致癌物質(zhì)吹入空氣中，嚴重污染空氣.直接對高溫污水進行微生物降解處理就變得更為急迫和重要.

目前，已有不少有關高溫嗜油菌的分離、篩選和鑒定等研究工作的報道，但也存在一些實際應用的問題.本文首先總結了常溫和高溫嗜油菌在降解石油方面的共同點，然后從細胞形態(tài)特征、生理生化特性、分子水平以及蛋白質(zhì)組和基因組等方面分析了常溫菌和高溫菌，特別是常溫和高溫嗜油菌之間的不同點，為進一步改良高溫嗜油菌有效性能提供理論參考.

1嗜油菌降解石油的作用機理及相關因素

嗜油菌將石油組分及其降解物作為主要的碳源和能源[13].嗜油菌產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)先乳化分散油脂形成懸浮于水中的微小油滴；表面活性物質(zhì)還可降低油滴與嗜油菌細胞壁的表面張力，使微小油滴吸附在嗜油菌的表面，最后進入嗜油菌體內(nèi)而被分解或積累[3].

在石油烴中，直鏈烴類易被氧化，芳烴和環(huán)烷烴的氧化困難.單末端氧化是最主要的方式[2]，如嗜油菌對正鏈烷的氧化首先是在單氧化酶系作用下，將氧分子的一個氧原子加入到烴中，使其形成相應的醇，另一個氧原子與烴類脫下的氫結合形成水.正鏈烷被氧化成相應的醇后，在脫氫酶的作用下，接著被氧化成相應的醛和酸.脂肪酸再通過β氧化和三羧酸循環(huán)進一步氧化成二氧化碳和水[3].

對難降解的有機物，需要有多種酶和/或多種微生物的參與，其中的一種酶或微生物的產(chǎn)物可以成為另外一種酶或微生物的底物，形成降解鏈.在高溫條件下，原油本身的粘度相對于低溫或常溫下較低，更有利于石油降解.

參與降解有機物的催化反應過程的酶多為誘導酶[14].通過對銅綠假單胞菌種烷烴代謝途徑的研究發(fā)現(xiàn)幾種酶能夠同時被誘導合成，實現(xiàn)短鏈烷烴的氧化作用，產(chǎn)生相應的醛和脂肪酸[15].

嗜油菌代謝的功能還可以通過同種或不同種微生物之間的遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移而實現(xiàn)的，隨著嗜油菌降解酶的基因在環(huán)境中的擴散轉(zhuǎn)移，嗜油菌對難降解有機物的降解能力也逐漸加強，遺傳物質(zhì)在嗜油菌種群間的轉(zhuǎn)移是嗜油菌對難降解有機物的適應并利用的一種主動機制(嗜油菌的馴化過程).

2細胞表層結構

高溫菌內(nèi)的所有物質(zhì)(脂類、核酸和蛋白質(zhì)等大分子)都必須耐熱，才能夠維持細胞的正常生長和增殖[16].這就要求它們有一些特殊的成分和/或形成特殊的結構.

細胞壁是細菌的基本結構，是細胞表面的堅硬外殼，保護細胞免受損傷和滲透溶解[17].在一些極端條件如高溫中生長的微生物中，其細胞表面通常會覆蓋一些特殊的結構，如嗜熱棲熱菌的胞壁在電子顯微鏡下表現(xiàn)為一個復雜的4層結構[18]，其中一層是由聚合糖蛋白單分子有規(guī)則排列的蛋白質(zhì)結構，稱為S-層(表面層).此S-層作為外層保護殼，也可作為分子篩和/或細胞胞外酶粘附位點.在細菌中，S-層與肽聚糖或外膜的次生細胞壁聚合物有關.在古細菌中，S-層蛋白被錨定在細胞質(zhì)膜上形成細胞壁的主要組成部分[18-19].

3細胞膜成分

細胞膜中含有大量的脂類，如糖脂和脂肪酸，它們的種類、結構和含量在常溫菌和高溫菌之間也不同[2].嗜熱古細菌的細胞膜通常含有甘油—醚鍵，而常溫菌細胞膜中含有甘油—酯鍵.醚鍵比酯鍵更穩(wěn)定，酯鍵在酸堿和熱等條件下更容易降解[20].再如，大腸桿菌在高溫下生長時，細胞膜中增加的是飽和脂肪酸的含量，降低的是不飽和脂肪酸的含量.同理，在高溫細菌中，長鏈飽和脂肪酸含量比不飽和脂肪酸的含量高，且隨著溫度的提高，細胞膜中的長鏈飽和脂肪酸含量隨之繼續(xù)增加.

當生長溫度從40℃提高到60℃時，嗜熱脂肪芽孢桿菌細胞膜中的16碳脂肪酸的含量增加了3～4倍，而不飽和脂肪酸含量相應減少.水生棲熱菌在50～70℃生長時，其細胞膜中增加最多的是16碳支脂肪酸，而不飽和脂肪酸的含量則降低[20].高溫細菌可能是通過細胞膜中長鏈飽和脂肪酸含量增加來提高機體抗熱能力.

增加細胞膜中糖脂的含量也有利于提高棲熱細菌的抗高溫能力[21].棲熱細菌生長75℃時，其細胞膜中總脂含量比50℃時高70%以上，其中糖脂增加了4倍.

由此可以看出，高溫微生物能夠在高溫環(huán)境中生長并繁殖，有其獨特的適應機制，如：特殊的胞被和細胞膜結構，有不同的細胞膜脂的類型和含量，如異型脂肪酸、穩(wěn)定型脂肪酸和環(huán)烷型脂肪酸等，為耐熱菌細胞膜耐受高溫提供了有利條件.

4生理生化特性比較

4.1蛋白質(zhì)比較

高溫菌在更高的溫度下生長更快，其細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和酶抵抗變性的能力更強[10]，這些耐熱蛋白與耐熱酶的出現(xiàn)，有利于細胞適應高溫環(huán)境，大大增加了機體的熱穩(wěn)定性，這就是氨基酸的突變適應[2].

對常溫和高溫菌蛋白質(zhì)的比較研究后發(fā)現(xiàn)，氫鍵、鹽橋、疏水基團之間的相互作用和氨基酸類型、數(shù)量被認為是影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的重要因素.

通過比較12個不同基因組的研究發(fā)現(xiàn)，來自高溫菌的蛋白質(zhì)比常溫菌蛋白質(zhì)的氨基酸殘基數(shù)目少，而且?guī)щ姲被岬暮窟h高于常溫菌.在高級結構中，高溫菌中帶電氨基酸的距離一般是1～4個螺旋，有較多的鹽橋和側鏈-側鏈之間的氫鍵，且鹽橋的極性方向與螺旋偶極方向一致[22].此外，對高溫菌和常溫菌之間同源蛋白質(zhì)序列比較表明，在高溫菌的蛋白質(zhì)中，精氨酸和酪氨酸更頻繁，而胱氨酸和絲氨酸在嗜熱蛋白質(zhì)更少[23-24].在系統(tǒng)分析8個高溫和12個常溫菌完整基因組的可溶性蛋白質(zhì)序列后，找出了一些影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的因素，結果發(fā)現(xiàn)相對于常溫菌來說，高溫菌的蛋白質(zhì)大小降低，增加參與β-鏈、螺旋和氫鍵的殘基數(shù)量，顯著增加了帶電氨基酸和疏水氨基酸的數(shù)量.在嗜熱蛋白質(zhì)中帶電荷氨基酸和疏水的β-支鏈氨基酸含量比常溫蛋白質(zhì)高，而不帶電荷的極性氨基酸的含量比常溫蛋白質(zhì)低.由此可見，減小蛋白質(zhì)長度、增加參與形成氫鍵的氨基酸殘基的數(shù)目、通過鹽橋穩(wěn)定螺旋結構、增加β-折疊的比例都可以增強蛋白質(zhì)的穩(wěn)定度[25].

另一方面，有研究從高分辨率X-射線晶體結構入手，試圖找出高溫菌蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性的因素.結果顯示：(1)在高溫菌中，絲氨酸和蘇氨酸的靈活性比較低；(2)在高溫菌的蛋白質(zhì)中谷氨酸和賴氨酸的比例高，絲氨酸和蘇氨酸的比例低.這些結果反映出高溫和常溫蛋白質(zhì)動力學的差異，因此氨基酸替換可能改變蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性[26].比較高溫和常溫菌的鐵氧還蛋白、3-磷酸甘油醛脫氫酶和乳酸脫氫酶的氨基酸序列，結果表明常溫菌中的甘氨酸、絲氨酸、賴氨酸和天冬氨酸在高溫菌中分別被丙氨酸、蘇氨酸、精氨酸和谷氨酸所取代.這些并不改變蛋白質(zhì)分子骨架構象的細微變化卻增加了蛋白質(zhì)的耐熱性.這種效應是由于增加了蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水作用，減少了分子表面的疏水力，同時，丙氨酸增加了螺旋的穩(wěn)定性[27].

4.2DNA比較

高溫細菌的基因組中，G+C含量通常比常溫細菌高[28]，DNA的解鏈溫度(Tm)較高[20，29]，嗜熱脂肪芽孢桿菌基因的密碼子的第三位對G/C有偏愛，有利于高溫中保持DNA分子的穩(wěn)定性，而且高溫菌DNA雙螺旋結構中氫鍵的數(shù)量大于常溫菌DNA的氫鍵數(shù)[30].

線性DNA通過鏈的分離很容易變性，但環(huán)狀DNA分子卻能夠耐受較高的變性溫度，因此DNA雙鏈在高溫條件下維持其二級結構是完全可能的.而且，無論是正超螺旋還是負超螺旋，都能夠進一步增加DNA的解鏈溫度.

特殊蛋白質(zhì)結合在DNA上可增加遺傳物質(zhì)對抗熱變性.例如在嗜熱棲熱菌中，一個顯著特征是罕見的細胞多胺的組合物，除了正常的多胺(腐胺、亞精胺和精)，還有包括長多胺和支鏈多胺，這在其他細菌中少見[31]，提示這些多胺在高溫下的化學反應中的重要作用.據(jù)報道，這樣的多胺對高溫菌的蛋白質(zhì)合成的是必不可少，有助于30S核糖體亞基、mRNA和起始氨酰tRNA之間形成適當?shù)钠鹗紡秃衔锝Y構[32].多胺也能夠有效維持RNA和DNA熱穩(wěn)定性[31-32].極端嗜熱菌中tRNA轉(zhuǎn)錄后經(jīng)過相關的修飾有利于適應高溫環(huán)境，RNA螺旋側面突起的堿基和近端酯鍵之間的配對也能夠避免結構上的不穩(wěn)定性[33].

5結語

綜上所述，與常溫菌相比，高溫菌細胞表層具有富含蛋白質(zhì)的S-層結構；細胞膜中的醚鍵和長鏈飽和脂肪酸較多；蛋白質(zhì)較短、氫鍵較多、鹽橋結構增強、蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水作用增加；DNA中G+C含量較高和特殊的多胺等，這些都可能是高溫菌的生存策略.

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[責任編輯馬云彤]

Vol.18No.3Jul.2015