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        4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯對人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231誘導(dǎo)分化作用及可能的機(jī)制研究

        2015-03-01 03:04:27陳飛虎葛金芳高文凡鄧子云安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院安徽合肥230032
        中國藥理學(xué)通報(bào) 2015年7期
        關(guān)鍵詞:維甲酸細(xì)胞株細(xì)胞周期

        雷 靜,陳飛虎,葛金芳,李 悅,高文凡,鄧子云(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,安徽合肥 230032)

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        4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯對人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231誘導(dǎo)分化作用及可能的機(jī)制研究

        雷靜,陳飛虎,葛金芳,李悅,高文凡,鄧子云
        (安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,安徽合肥230032)

        中國圖書分類號: R329.24; R329.11; R737.902.2; R916.4

        摘要:目的觀察4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯(4-anino-2-trifluoromethyl-phenyl retimate,ATPR)對人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231抑制增殖誘導(dǎo)分化作用,探討其可能的作用機(jī)制。方法體外培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231,MTT檢測細(xì)胞增殖,繪制細(xì)胞生長曲線,瑞氏-吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化,酶聯(lián)免疫法檢測粘蛋白MUC-1活性,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期,實(shí)時熒光定量PCR法和Western blot法檢測維甲酸受體(retinoic acid receptors,RAR)RARα、RARβ、RARγ和維甲類受體(retinoid X receptors,RXR)RXRα、RXRβ、RXRγ基因和蛋白的表達(dá)。結(jié)果ATPR能夠抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖,具有濃度-時間依賴性,染色后鏡下觀察MDA-MB-231細(xì)胞生長密度降低,形態(tài)趨于正常。ELISA結(jié)果顯示,ATPR作用后明顯降低MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)上清中MUC-1的濃度;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,MDA-MB-231細(xì)胞中G0/G1期表達(dá)量增加,S期表達(dá)量減少,細(xì)胞阻滯在G0/G1期比例增加。q-RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,ATPR作用后,RARγ的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低,RXRs mRNA和蛋白水平無明顯變化。結(jié)論ATPR可以抑制人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231增殖并誘導(dǎo)其分化,其機(jī)制可能與RARγ的表達(dá)有關(guān)。

        關(guān)鍵詞:全反式維甲酸;4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯;誘導(dǎo)分化; MDA-MB-231細(xì)胞;維甲酸受體;維甲類受體;雌激素受體;

        網(wǎng)絡(luò)出版時間:2015-6-5 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.017.html

        陳飛虎(1962-),男,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向:分子藥理學(xué),通訊作者,Tel: 0551-65161116,E-mail: cfhchina @ sohu.com

        維甲酸類化合物在脊椎動物發(fā)育、細(xì)胞分化和維持機(jī)體平衡中發(fā)揮著非常廣泛的效應(yīng),在體內(nèi)生理活性代謝產(chǎn)物包括全反式維甲酸、13-順式維甲酸、9-順式維甲酸,它們可以通過和細(xì)胞核內(nèi)維甲酸受體(RARs)和維甲類受體(RXRs)結(jié)合于DNA的應(yīng)答元件,進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá),發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)分化作用。全反式維甲酸(all trans retinoic acid,ATRA)作為誘導(dǎo)分化劑的代表目前廣泛用于急性早幼粒白血病的臨床治療[1],但同時存在維甲酸綜合征耐藥性等不足限制其進(jìn)一步臨床使用[2-4]。本實(shí)驗(yàn)室以ATRA為先導(dǎo)化合物,通過對其碳鏈末端極性基團(tuán)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,合成了一系列新的維甲酸衍生物,經(jīng)過體外藥效學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯具有較強(qiáng)的抗腫瘤增殖和誘導(dǎo)分化活性,有望成為一種新型抗腫瘤藥。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯(4-anino-2-trifluoromethyl-phenyl retimate,ATPR)對多種腫瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)分化作用[5-8],本實(shí)驗(yàn)觀察ATPR對人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231是否具有誘導(dǎo)分化作用,并探究ATPR對維甲酸受體RARs及維甲類受體RXRs表達(dá)的影響。

        1 材料與方法

        1.1材料新型維甲酸衍生物由安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院合成(Fig 1),純度為99. 66 %,溶于無水乙醇,配制成1×10-2mol·L-1濃度,-20℃儲存?zhèn)溆谩8咛荄MEM培養(yǎng)液為Hyclone公司產(chǎn)品;胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;瑞氏-吉姆薩染料購自南京建成生物工程研究所; MUC-1試劑盒為美國R&D公司產(chǎn)品;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒均為Promage公司產(chǎn)品; q-PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;實(shí)時熒光定量PCR儀,立陶宛Fermentas公司產(chǎn)品;抗RARα、RARβ、RARγ、RXRα、RXRβ、RXRγ抗體購自Santa Cruz公司;β-actin抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

        Fig 1 Chemical structure of 4-Amino-2-Trifluoromethyl-Phenyl Retinate(ATPR)

        1.2細(xì)胞培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞所,采用含10 %胎牛血清(FCS)的DMEM培養(yǎng)液,并加入青霉素105IU·L-1和鏈霉素100 mg ·L-1的培養(yǎng)體系培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境為37℃,5 % CO2培養(yǎng)箱,每2天換1次液,取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

        1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖將MDA-MB-231細(xì)胞以3×104個/孔的濃度接種于96孔培養(yǎng)板,每孔接種量為100 μL。待細(xì)胞貼壁后,分為空白對照組(加入DMEM培養(yǎng)液100 μL)、溶劑對照組(含0. 05 %無水乙醇)、陽性對照組ATRA(10-5mol·L-1)及ATPR(10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol·L-1)組,每組設(shè)6個復(fù)孔,每孔的總體積為200 μL。分別于24、48、72、96 h后更換為無血清培養(yǎng)液,并加入MTT(濃度為5 g·L-1)20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,棄上清,每孔加入150 μL的DMSO,震蕩搖勻,使甲瓚顆粒充分溶解。于酶聯(lián)免疫檢測儀上,以波長490 nm,試劑對照組調(diào)零,測吸光度(A490)值,重復(fù)3次,取其平均值,并用SPSS計(jì)算IC50值。

        1.4細(xì)胞生長曲線繪制將MDA-MB-231細(xì)胞以1×104個/孔的濃度接種于24孔培養(yǎng)板,每孔接種量為1 mL。待細(xì)胞貼壁后,實(shí)驗(yàn)分組同“1. 3”,將其置于37℃含5 % CO2培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)1~7 d。每天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),每個時間點(diǎn)設(shè)3個復(fù)孔,取其均值,以培養(yǎng)時間為橫軸,細(xì)胞計(jì)數(shù)為縱軸,繪制細(xì)胞生長曲線。

        1.5細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察以1×106個/孔的濃度接種于6孔板,每孔加入蓋玻片,將細(xì)胞懸液滴于蓋玻片上,實(shí)驗(yàn)分組同1.3,作用72 h收集蓋玻片,用PBS沖洗蓋玻片,甲醇固定10 min,自然干燥,在蓋玻片上依次滴加瑞氏-吉姆薩染料A液和B液,流水沖洗細(xì)胞,干燥后在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

        1.6分化標(biāo)志物MUC-1檢測取對數(shù)生長期細(xì)胞,以1×104個/孔的濃度接種于24孔板,待細(xì)胞貼壁后,實(shí)驗(yàn)分組同1.3,作用72 h后,收集細(xì)胞上清,3 000 r·min-1離心10 min后,參照試劑盒方法檢測MUC-1。

        1.7細(xì)胞周期和DNA倍體分析取對數(shù)生長期細(xì)胞,以1×106個/孔的濃度接種于6孔板,實(shí)驗(yàn)分組同1.3,作用72h后,收集細(xì)胞,用PBS洗滌2次,70%冷乙醇-20℃冰箱固定過夜。固定后的細(xì)胞離心,棄上清,加入碘化丙啶(PI,終濃度為100 mg· L-1)和RNase(終濃度為50 mg·L-1),4℃避光染色30 min后,在EPICS XL-MCL型流式細(xì)胞儀上分析,檢測3×104以上細(xì)胞,并用ModfitLT軟件進(jìn)行DNA倍體及細(xì)胞周期分析。

        1.8實(shí)時定量熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(q-RTPCR)檢測RARα、RARβ、RARγ、RXRα、RXRβ、RXRγmRNA的表達(dá)

        1.8.1 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄將1×109·L-1細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶,實(shí)驗(yàn)分為空白對照組(加入DMEM培養(yǎng)液)、溶劑對照組(含0.05%無水乙醇)、陽性對照組ATRA(10-5mol·L-1)及ATPR(10-5mol ·L-1)組,作用72 h后,按TRIzol一步法提取細(xì)胞中總RNA,以紫外分光光度計(jì)測RNA含量和純度(RNA在260和280 nm的光密度比值為1. 8~2. 0),以1. 5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性(28S 和18SRNA條帶比值I>2. 0),用5 μg總RNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

        Tab 1 Oligonucleotide primer sequences used for q-RT-PCR analysis

        1.8.2 q-RT-PCR將cDNA用無酶水稀釋10倍,上、下游引物各稀釋10倍后,按以下體系將反應(yīng)物加至q-RT-PCR反應(yīng)板中,每組至少3個復(fù)孔,冰上操作: Syber green I: 5 μL; cDNA: 0. 5 μL; P1: 0. 3 μL; P2:0. 3 μL;無酶水: 3. 9 μL共10 μL體系。反應(yīng)條件1:預(yù)變性95℃,10 min;變性95℃15 s;反應(yīng)條件2:退火95℃15 s;60℃30 s;延伸72℃30 s,45個循環(huán)后,延伸7℃230 s。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后取出96孔反應(yīng)板,關(guān)閉儀器,分析數(shù)據(jù),若觀察到各基因熔解曲線為銳利的單一峰,說明擴(kuò)增序列特異性強(qiáng),定量準(zhǔn)確。

        1.9 Western blot檢測RARα、RARβ、RARγ、RXRα、RXRβ、RXRγ蛋白的表達(dá)將1×109·L-1細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中,實(shí)驗(yàn)分組同“1. 8. 1”,作用72 h后,棄培養(yǎng)液,用預(yù)冷的PBS洗3遍,每瓶加入400μL RIPA裂解液(含10 % PMSF)裂解30 min,用細(xì)胞刮快速將細(xì)胞轉(zhuǎn)入1. 5 mL EP管中,離心取上清,用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量。將上清與上樣緩沖液按4∶1進(jìn)行分裝,100℃煮10 min變性,-80℃保存待用。等量的蛋白樣品進(jìn)行SDSPAGE,將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。TBST洗膜10 min,室溫下用含5 %的脫脂奶粉(TBST溶解)封閉3 h,隨后加入一抗(1∶300)4℃孵育過夜,TBST洗脫4次,加入相應(yīng)的二抗孵育1 h,用TBST漂洗4次,將PVDF膜用化學(xué)發(fā)光劑染色1 min。

        2 結(jié)果

        2.1 ATPR對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響如Tab 2所示,與空白對照組相比,溶劑對照組A490變化不明顯,表明無水乙醇(0.05 %)作為溶劑對細(xì)胞增殖無影響,因此可排除無水乙醇對本實(shí)驗(yàn)的影響。顯微鏡下觀察各組細(xì)胞發(fā)現(xiàn),與溶劑對照組比較,ATPR(10-4mol·L-1)體外給藥24 h時即對MDA-MB-231細(xì)胞的增殖產(chǎn)生明顯影響,細(xì)胞形態(tài)皺縮,細(xì)胞凋亡; ATPR(10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol·L-1)體外給藥24 h時對MDA-MB-231細(xì)胞增殖并無明顯影響,但作用48、72和96 h后,ATPR(10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol·L-1)對細(xì)胞增殖均具有不同程度的抑制作用。如Fig 2所示,72 h時ATPR對MDA-MB-231細(xì)胞抑制作用的IC50值最低。

        Tab 2 Effects of ATPR on the proliferation of MDA-MB-231 cells(±s,n =3)

        Tab 2 Effects of ATPR on the proliferation of MDA-MB-231 cells(±s,n =3)

        **P<0.05,**P<0.01 vs the solvent group.

        Concentration/A490 Group-124 h 48 h 72 h 96 h mol·L Control 0.303±0.02  0.537±0.055  0.867±0.0690.942±0.043 Solvent 0.329±0.04  0.535±0.041  0.972±0.023  0.951±0.040 ATPR  10-4 0.081±0.016**0.079±0.018**0.088±0.009**0.070±0.06**10-5 0.325±0.038  0.477±0.036*0.584±0.068**0.668±0.104*10-6  0.349±0.050  0.489±0.055*  0.606±0.018**0.735±0.074* 10-7  0.362±0.030  0.552±0.049  0.604±0.084*  0.772±0.112 10-8  0.359±0.047  0.563±0.067  0.764±0.044  0.851±0.091 10-9 0.363±0.034  0.597±0.068  0.789±0.104  0.914±0.103 ATRA  10-5 0.331±0.038  0.463±0.03** 0.578±0.074**0.642±0.073

        3.2 MDA-MB-231細(xì)胞生長曲線繪制臺盼藍(lán)染色后繪制細(xì)胞生長曲線,結(jié)果如Fig 3所示,與溶劑對照組比較,ATPR濃度越大,細(xì)胞生長曲線越低平,其中10-5mol·L-1ATPR對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用最強(qiáng),用藥后24h開始出現(xiàn)抑制作用,并且在72 h抑制作用最明顯,說明ATPR對MDAMB-231細(xì)胞的抑制作用具有濃度-時間依賴性。

        Fig 2 ATPR inhibits the half inhibition concentration(IC50)in MDA-MB-231 cells(±s,n =3)

        Fig 3 Growth curves of MDA-MB-231 cells treated with ATPR(±s,n =3)**P<0. 01 vs the solvent group.

        2.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察不同濃度ATPR作用后,MDA-MB-231細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化如Fig 4所示,正常組細(xì)胞生長密度大,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,ATPR用藥后細(xì)胞生長密度降低,核質(zhì)比降低,細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,細(xì)胞形態(tài)隨藥物濃度增加改變越明顯。

        2.4分化標(biāo)志物MUC-1的檢測ATPR作用后觀察MDA-MB-231細(xì)胞上清中MUC-1的變化,結(jié)果如Tab 3所示,與溶劑對照組相比,MUC-1含量隨ATPR濃度的升高而下降,ATPR濃度為10-5mol·L-1時MUC-1含量下降最明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2.5 MDA-MB-231細(xì)胞周期變化如Fig 5所示,F(xiàn)CM檢測細(xì)胞周期顯示,與溶劑對照組相比,ATRA(10-5mol·L-1)和ATPR(10-5、10-6mol·L-1)用藥后,G0/G1期細(xì)胞百分比上升,S期細(xì)胞百分比下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05); G2/M期細(xì)胞改變不明顯。結(jié)果表明ATPR影響MDA-MB-231細(xì)胞周期,將細(xì)胞阻滯在G0/G1期。

        Fig 4 Effect of ATPR on the morphological changes of MDA-MB-231 cells after 72h(400×)1: Control;2: Solvent;3: ATPR(10-5mol·L-1);4: ATPR(10-6mol·L-1); 5: ATPR(10-7mol·L-1); 6: ATPR(10-8mol·L-1); 7: ATPR(10-9mol·L-1);8: ATRA(10-5mol·L-1).

        Fig 5 Change of cell cycle distribution of MDA-MB-231 cells treated with ATPR(n =3,±s)1: Control;2: Solvent;3: ATPR(10-5mol·L-1);4: ATPR(10-6mol·L-1);5: ATPR(10-7mol/L);6: ATPR(10-8mol·L-1);7: ATPR(10-9mol·L-1);8: ATRA(10-5mol·L-1),*P<0.05,**P<0. 01 vs the solvent group.

        Tab 3 Effect of ATPR on the concentration of mucin 1(MUC-1)(±s,n =3)

        Tab 3 Effect of ATPR on the concentration of mucin 1(MUC-1)(±s,n =3)

        *P<0. 05,**P<0. 01 vs the solvent group.

        Group  Concentration/mol·L-1 MUC-1/kU·L-1Control ?。?1.49±1.66 Solvent  - 61.00±1.28 ATPR 10-5 43.87±1.37**10-6 51.31±2.22*10-7 54.08±3.39 10-8 57.55±3.59 10-9 59.47±1.48 ATRA 10-5 44.08±2.25

        2.6 RARα、RARβ、RARγ、RXRα、RXRβ、RXRγ mRNA的表達(dá)結(jié)果如Fig 6所示,與溶劑對照組相比,ATPR(10-5mol·L-1)作用后,RARα、RARβ mRNA表達(dá)無明顯變化,RARγ mRNA表達(dá)下降,RXRα、RXRβ、RXRγ mRNA表達(dá)無明顯變化。提示ATPR用藥后MDA-MB-231細(xì)胞RARγ mRNA表達(dá)下降。

        2.7 RARα、RARβ、RARγ、RXRα、RXRβ、RXRγ蛋白的表達(dá)結(jié)果如Fig 7所示,與溶劑對照組相比,ATPR(10-5mol·L-1)作用后,RARα、RARβ蛋白表達(dá)無明顯變化,RARγ蛋白表達(dá)下降,RXRα、RXRβ、RXRγ蛋白表達(dá)無明顯變化。提示ATPR用藥后MDA-MB-231細(xì)胞RARγ蛋白表達(dá)下降。

        3 討論

        乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤,目前對乳腺癌的治療手段包括手術(shù)治療、全身化療、放射治療及內(nèi)分泌治療等[9]。放化療通常不具有選擇性,既能殺死腫瘤細(xì)胞,又殺死了大量的正常細(xì)胞。20世紀(jì)80年代Sachs[10]發(fā)現(xiàn)在一些抑制增殖和誘導(dǎo)分化的物質(zhì)作用下,小鼠白血病細(xì)胞系的異常分化是可逆的,由此提出了誘導(dǎo)分化治療的概念。誘導(dǎo)分化治療的基本特點(diǎn)是不直接殺傷腫瘤細(xì)胞,而是誘導(dǎo)其分化為正?;蚪咏5募?xì)胞,減慢腫瘤細(xì)胞增殖速度,最終使惡性腫瘤緩解,從而避免常規(guī)放、化療所引起的骨髓抑制、免疫抑制等毒副作用[11]。全反式維甲酸作為經(jīng)典的誘導(dǎo)分化劑,已廣泛應(yīng)用于急性早幼粒白血病的臨床治療,但ATRA存在一系列的問題,如維甲酸綜合征耐藥等影響其療效,本課題組以ATRA為先導(dǎo)化合物,合成的維甲酸衍生物ATPR對多種腫瘤細(xì)胞株具有抑制增殖誘導(dǎo)分化作用,前期研究發(fā)現(xiàn),ATPR對雌激素受體陽性人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7具有誘導(dǎo)分化作用,本實(shí)驗(yàn)探討在雌激素受體陰性人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231上,ATPR對其是否具有誘導(dǎo)分化作用?實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ATPR抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖存在濃度-時間依賴性行為。

        Fig 6 Effect of ATPR on the mRNA expression of retinoic acid receptors(RARs)and Retinoid X acid receptor(RXRs)in MDAMB-231 cells(n =3,±s)1: Control; 2: Solvent; 3: ATRA(10-5mol·L-1); 4: ATPR(10-5mol·L-1).**P<0. 01 vs the solvent group.

        Fig 7 Effect of ATPR on the proteins expression of retinoic acid receptors(RARs)and retinoid X receptors(RXRs)in MDA-MB-231 cells(n =3,±s)1: Control;2: Solvent; 3: ATRA(10-5mol·L-1); 4: ATPR(10-5mol·L-1).**P<0. 01 vs the solvent group.

        細(xì)胞分化主要表現(xiàn)在形態(tài)和功能兩個方面,形態(tài)分化是細(xì)胞分化的基本特征。瑞氏-吉姆薩染色結(jié)果顯示,MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)ATPR處理后形態(tài)發(fā)生改變,細(xì)胞生長密度下降,核質(zhì)比降低。MUC-1是一種在上皮性腫瘤高度或異常表達(dá)的膜糖蛋白,常作為乳腺癌細(xì)胞分化程度的一個重要指標(biāo)[12]。研究發(fā)現(xiàn),ATPR作用后,MDA-MB-231細(xì)胞分泌MUC-1含量為(43. 87±1. 37)kU·L-1,較溶劑對照組(61. 00±1. 28)kU·L-1差異有顯著性。細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變和分化標(biāo)志物MUC-1含量的變化都說明ATPR對MDA-MB-231細(xì)胞具有誘導(dǎo)分化作用。

        腫瘤細(xì)胞的周期學(xué)特點(diǎn)是細(xì)胞群體主要分布于DNA合成活躍S期,而分化細(xì)胞群體主要分布于DNA合成靜止的G1/G0期。因此細(xì)胞周期不可逆的阻滯于G0/G1期是細(xì)胞分化的重要特征。本研究結(jié)果顯示,MDA-MB-231細(xì)胞周期發(fā)生明顯改變,G0/G1期的細(xì)胞比例增多,S期細(xì)胞比例下降,呈明顯的G0/G1期阻滯。說明ATPR可以調(diào)控MDAMB-231細(xì)胞周期,將其阻滯在G0/G1期比例升高,具有誘導(dǎo)分化效果。

        維甲酸受體屬于核受體超家族中的一個子家族,在這個超家族中還包括甾體類、維生素D和甲狀腺激素受體及過氧化物酶體增殖物激活受體、昆蟲脫皮類固醇受體和許多尚未知其配體的孤兒受體。Ayaori等[13]研究表明,維甲酸類化合物如ATRA、9cis RA首先通過與細(xì)胞質(zhì)的維甲酸結(jié)合蛋白Ⅰ、Ⅱ(CRABPⅠ、CRABPⅡ)結(jié)合,轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核,與核受體RARs和RXRs形成的同/異二聚體結(jié)合,從而發(fā)揮抑制細(xì)胞生長、分化以及凋亡等調(diào)節(jié)作用。維甲酸受體子家族包括: RARs和RXRs,分別有α、β、γ 3種亞型。有文獻(xiàn)指出在激素依賴性和非激素依賴性乳腺癌中,維甲酸作用后,維甲酸受體表達(dá)各不相同,在MDA-MB-231細(xì)胞中RARα、RXRα的表達(dá)非常低[14]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ATPR抑制MCF-7細(xì)胞增殖過程中,維甲酸受體RARs、雌激素受體ERs的表達(dá)發(fā)生變化。根據(jù)這一現(xiàn)象我們探討維甲酸受體在ATPR對MDA-MB-231細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程發(fā)揮怎樣的變化? q-PCR和Western blot結(jié)果表明與溶劑對照組相比,ATPR用藥后,RARγ的表達(dá)降低,RARα、RARβ、RXRα、RXRβ和RXRγ表達(dá)無明顯變化。上述結(jié)果提示,ATPR對MDA-MB-231細(xì)胞中不同的維甲酸受體表達(dá)的影響是不同的,與文獻(xiàn)的研究結(jié)果一致[14]。

        (本實(shí)驗(yàn)在安徽省天然藥物活性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成,衷心感謝導(dǎo)師陳飛虎教授對我的課題悉心指導(dǎo),感謝葛金芳老師在我實(shí)驗(yàn)遇到困難時耐心解答,感謝實(shí)驗(yàn)室的同學(xué)們在實(shí)驗(yàn)期間對我實(shí)驗(yàn)技術(shù)的幫助,最后感謝母校安徽醫(yī)科大學(xué)給我提供良好的學(xué)習(xí)環(huán)境。)

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        Inducing effect of 4-Amino-2-Trifluoromethyl-Phenyl Retinate on differentiation of human breast cancer MDA-MB-231 cell and its possible mechanisms

        LEI Jing,CHEN Fei-hu,GE Jin-fang,LI Yue,GAO Wen-fan,DENG Zi-yun
        (School of Pharmacy,Anhui Medical University,Hefei 230032,China)

        Abstract:Aim To investigate the effect of 4-Amino- 2-Trifluoromethyl-Phenyl Retinate on human breastcancer cells MDA-MB-231 and the possible mechanisms.Method Human breast cancer MDA-MB-231cells were incubated with different concentrations of ATPR in vitro.MTT assay was performed to measure the proliferation of MDA-MB-231.Cell growth curves were made by counting cells and morphologic changes were observed by Wright-Giemsa staining.The differentiation marker mucin-1(MUC-1)was measured by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).Cell cycle was examined by Flow cytometry(FCM).The expression of retinoic acid receptors(RARs)and retinoid X receptors(RXRs)were detected by Western blot and Quantitative real-time PCR(q-RT-PCR),respectively.Results Compared with solvent group,ATPR could inhibit the proliferation of MDA-MB-231 cells in a time-and dose dependent manner and induce the maturing and normality of morphology.The express of MUC-1 was significantly decreased,and the progres of cell cycle was blocked in the G0/G1-phase.The expression of RARγ was decreased.Conclusions ATPR could inhibit proliferation and induce differention of MDA-MB-231cells,it's associated with RARγ.

        Key words:ATRA; ATPR; differentiation; MDA-MB-231cells; RARs; RXRs; ERs

        作者簡介:雷靜(1988-),女,碩士生,研究方向:中藥藥理學(xué),E-mail: leijing99@126.com;

        基金項(xiàng)目:國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(No 2011ZX09401)

        收稿日期:2015-03-14,修回日期:2015-04-07

        文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

        文章編號:1001-1978(2015)07-0973-07

        doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.07.017

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