雷　靜，陳飛虎，葛金芳，李　悅，高文凡，鄧子云(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥　230032)

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4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯對人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231誘導(dǎo)分化作用及可能的機(jī)制研究

雷靜，陳飛虎，葛金芳，李悅，高文凡，鄧子云
(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥230032)

中國圖書分類號: R329.24; R329.11; R737.902.2; R916.4

摘要:目的觀察4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯(4-anino-2-trifluoromethyl-phenyl retimate，ATPR)對人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231抑制增殖誘導(dǎo)分化作用，探討其可能的作用機(jī)制。方法體外培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，MTT檢測細(xì)胞增殖，繪制細(xì)胞生長曲線，瑞氏-吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化，酶聯(lián)免疫法檢測粘蛋白MUC-1活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，實(shí)時熒光定量PCR法和Western blot法檢測維甲酸受體(retinoic acid receptors，RAR)RARα、RARβ、RARγ和維甲類受體(retinoid X receptors，RXR)RXRα、RXRβ、RXRγ基因和蛋白的表達(dá)。結(jié)果ATPR能夠抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，具有濃度-時間依賴性，染色后鏡下觀察MDA-MB-231細(xì)胞生長密度降低，形態(tài)趨于正常。ELISA結(jié)果顯示，ATPR作用后明顯降低MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)上清中MUC-1的濃度;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，MDA-MB-231細(xì)胞中G0/G1期表達(dá)量增加，S期表達(dá)量減少，細(xì)胞阻滯在G0/G1期比例增加。q-RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，ATPR作用后，RARγ的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，RXRs mRNA和蛋白水平無明顯變化。結(jié)論ATPR可以抑制人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231增殖并誘導(dǎo)其分化，其機(jī)制可能與RARγ的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞:全反式維甲酸;4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯;誘導(dǎo)分化; MDA-MB-231細(xì)胞;維甲酸受體;維甲類受體;雌激素受體;

網(wǎng)絡(luò)出版時間:2015－6－5 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.017.html

陳飛虎(1962－)，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:分子藥理學(xué)，通訊作者，Tel: 0551-65161116，E-mail: cfhchina @ sohu.com

維甲酸類化合物在脊椎動物發(fā)育、細(xì)胞分化和維持機(jī)體平衡中發(fā)揮著非常廣泛的效應(yīng)，在體內(nèi)生理活性代謝產(chǎn)物包括全反式維甲酸、13-順式維甲酸、9-順式維甲酸，它們可以通過和細(xì)胞核內(nèi)維甲酸受體(RARs)和維甲類受體(RXRs)結(jié)合于DNA的應(yīng)答元件，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)分化作用。全反式維甲酸(all trans retinoic acid，ATRA)作為誘導(dǎo)分化劑的代表目前廣泛用于急性早幼粒白血病的臨床治療［1］，但同時存在維甲酸綜合征耐藥性等不足限制其進(jìn)一步臨床使用［2－4］。本實(shí)驗(yàn)室以ATRA為先導(dǎo)化合物，通過對其碳鏈末端極性基團(tuán)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，合成了一系列新的維甲酸衍生物，經(jīng)過體外藥效學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯具有較強(qiáng)的抗腫瘤增殖和誘導(dǎo)分化活性，有望成為一種新型抗腫瘤藥。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯(4-anino-2-trifluoromethyl-phenyl retimate，ATPR)對多種腫瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)分化作用［5－8］，本實(shí)驗(yàn)觀察ATPR對人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231是否具有誘導(dǎo)分化作用，并探究ATPR對維甲酸受體RARs及維甲類受體RXRs表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1材料新型維甲酸衍生物由安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院合成(Fig 1)，純度為99. 66 %，溶于無水乙醇，配制成1×10－2mol·L－1濃度，－20℃儲存?zhèn)溆谩８咛荄MEM培養(yǎng)液為Hyclone公司產(chǎn)品;胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;瑞氏－吉姆薩染料購自南京建成生物工程研究所; MUC-1試劑盒為美國R＆D公司產(chǎn)品;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒均為Promage公司產(chǎn)品; q-PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;實(shí)時熒光定量PCR儀，立陶宛Fermentas公司產(chǎn)品;抗RARα、RARβ、RARγ、RXRα、RXRβ、RXRγ抗體購自Santa Cruz公司;β-actin抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

Fig 1　Chemical structure of 4-Amino-2-Trifluoromethyl-Phenyl Retinate(ATPR)

1.2細(xì)胞培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞所，采用含10 %胎牛血清(FCS)的DMEM培養(yǎng)液，并加入青霉素105IU·L－1和鏈霉素100 mg ·L－1的培養(yǎng)體系培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境為37℃，5 % CO2培養(yǎng)箱，每2天換1次液，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖將MDA-MB-231細(xì)胞以3×104個/孔的濃度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種量為100 μL。待細(xì)胞貼壁后，分為空白對照組(加入DMEM培養(yǎng)液100 μL)、溶劑對照組(含0. 05 %無水乙醇)、陽性對照組ATRA(10－5mol·L－1)及ATPR(10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9mol·L－1)組，每組設(shè)6個復(fù)孔，每孔的總體積為200 μL。分別于24、48、72、96 h后更換為無血清培養(yǎng)液，并加入MTT(濃度為5 g·L－1)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔加入150 μL的DMSO，震蕩搖勻，使甲瓚顆粒充分溶解。于酶聯(lián)免疫檢測儀上，以波長490 nm，試劑對照組調(diào)零，測吸光度(A490)值，重復(fù)3次，取其平均值，并用SPSS計(jì)算IC50值。

1.4細(xì)胞生長曲線繪制將MDA-MB-231細(xì)胞以1×104個/孔的濃度接種于24孔培養(yǎng)板，每孔接種量為1 mL。待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)分組同“1. 3”，將其置于37℃含5 % CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)1～7 d。每天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個時間點(diǎn)設(shè)3個復(fù)孔，取其均值，以培養(yǎng)時間為橫軸，細(xì)胞計(jì)數(shù)為縱軸，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.5細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察以1×106個/孔的濃度接種于6孔板，每孔加入蓋玻片，將細(xì)胞懸液滴于蓋玻片上，實(shí)驗(yàn)分組同1.3，作用72 h收集蓋玻片，用PBS沖洗蓋玻片，甲醇固定10 min，自然干燥，在蓋玻片上依次滴加瑞氏－吉姆薩染料A液和B液，流水沖洗細(xì)胞，干燥后在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.6分化標(biāo)志物MUC-1檢測取對數(shù)生長期細(xì)胞，以1×104個/孔的濃度接種于24孔板，待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)分組同1.3，作用72 h后，收集細(xì)胞上清，3 000 r·min－1離心10 min后，參照試劑盒方法檢測MUC-1。

1.7細(xì)胞周期和DNA倍體分析取對數(shù)生長期細(xì)胞，以1×106個/孔的濃度接種于6孔板，實(shí)驗(yàn)分組同1.3，作用72h后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，70%冷乙醇－20℃冰箱固定過夜。固定后的細(xì)胞離心，棄上清，加入碘化丙啶(PI，終濃度為100 mg· L－1)和RNase(終濃度為50 mg·L－1)，4℃避光染色30 min后，在EPICS XL-MCL型流式細(xì)胞儀上分析，檢測3×104以上細(xì)胞，并用ModfitLT軟件進(jìn)行DNA倍體及細(xì)胞周期分析。

1.8實(shí)時定量熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(q-RTPCR)檢測RARα、RARβ、RARγ、RXRα、RXRβ、RXRγmRNA的表達(dá)

1.8.1 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄將1×109·L－1細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，實(shí)驗(yàn)分為空白對照組(加入DMEM培養(yǎng)液)、溶劑對照組(含0.05%無水乙醇)、陽性對照組ATRA(10－5mol·L－1)及ATPR(10－5mol ·L－1)組，作用72 h后，按TRIzol一步法提取細(xì)胞中總RNA，以紫外分光光度計(jì)測RNA含量和純度(RNA在260和280 nm的光密度比值為1. 8～2. 0)，以1. 5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性(28S 和18SRNA條帶比值I＞2. 0)，用5 μg總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

Tab 1　Oligonucleotide primer sequences used for q-RT-PCR analysis

1.8.2 q-RT-PCR將cDNA用無酶水稀釋10倍，上、下游引物各稀釋10倍后，按以下體系將反應(yīng)物加至q-RT-PCR反應(yīng)板中，每組至少3個復(fù)孔，冰上操作: Syber green I: 5 μL; cDNA: 0. 5 μL; P1: 0. 3 μL; P2:0. 3 μL;無酶水: 3. 9 μL共10 μL體系。反應(yīng)條件1:預(yù)變性95℃，10 min;變性95℃15 s;反應(yīng)條件2:退火95℃15 s;60℃30 s;延伸72℃30 s，45個循環(huán)后，延伸7℃230 s。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后取出96孔反應(yīng)板，關(guān)閉儀器，分析數(shù)據(jù)，若觀察到各基因熔解曲線為銳利的單一峰，說明擴(kuò)增序列特異性強(qiáng)，定量準(zhǔn)確。

1.9 Western blot檢測RARα、RARβ、RARγ、RXRα、RXRβ、RXRγ蛋白的表達(dá)將1×109·L－1細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，實(shí)驗(yàn)分組同“1. 8. 1”，作用72 h后，棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗3遍，每瓶加入400μL RIPA裂解液(含10 % PMSF)裂解30 min，用細(xì)胞刮快速將細(xì)胞轉(zhuǎn)入1. 5 mL EP管中，離心取上清，用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量。將上清與上樣緩沖液按4∶1進(jìn)行分裝，100℃煮10 min變性，－80℃保存待用。等量的蛋白樣品進(jìn)行SDSPAGE，將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。TBST洗膜10 min，室溫下用含5 %的脫脂奶粉(TBST溶解)封閉3 h，隨后加入一抗(1∶300)4℃孵育過夜，TBST洗脫4次，加入相應(yīng)的二抗孵育1 h，用TBST漂洗4次，將PVDF膜用化學(xué)發(fā)光劑染色1 min。

2　結(jié)果

2.1 ATPR對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響如Tab 2所示，與空白對照組相比，溶劑對照組A490變化不明顯，表明無水乙醇(0.05 %)作為溶劑對細(xì)胞增殖無影響，因此可排除無水乙醇對本實(shí)驗(yàn)的影響。顯微鏡下觀察各組細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，與溶劑對照組比較，ATPR(10－4mol·L－1)體外給藥24 h時即對MDA-MB-231細(xì)胞的增殖產(chǎn)生明顯影響，細(xì)胞形態(tài)皺縮，細(xì)胞凋亡; ATPR(10－5、10－6、10－7、10－8、10－9mol·L－1)體外給藥24 h時對MDA-MB-231細(xì)胞增殖并無明顯影響，但作用48、72和96 h后，ATPR(10－5、10－6、10－7、10－8、10－9mol·L－1)對細(xì)胞增殖均具有不同程度的抑制作用。如Fig 2所示，72 h時ATPR對MDA-MB-231細(xì)胞抑制作用的IC50值最低。

Tab 2　Effects of ATPR on the proliferation of MDA-MB-231 cells(±s，n =3)

Tab 2　Effects of ATPR on the proliferation of MDA-MB-231 cells(±s，n =3)

**P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs the solvent group.

Concentration/A490 Group－124 h　48 h　72 h　96 h mol·L Control　0.303±0.02 　0.537±0.055 　0.867±0.0690.942±0.043 Solvent　0.329±0.04 　0.535±0.041 　0.972±0.023 　0.951±0.040 ATPR 　10－4　0.081±0.016＊＊0.079±0.018＊＊0.088±0.009＊＊0.070±0.06＊＊10－5　0.325±0.038 　0.477±0.036*0.584±0.068＊＊0.668±0.104*10－6 　0.349±0.050 　0.489±0.055* 　0.606±0.018＊＊0.735±0.074* 10－7 　0.362±0.030 　0.552±0.049 　0.604±0.084* 　0.772±0.112 10－8 　0.359±0.047 　0.563±0.067 　0.764±0.044 　0.851±0.091 10－9　0.363±0.034 　0.597±0.068 　0.789±0.104 　0.914±0.103 ATRA 　10－5　0.331±0.038 　0.463±0.03＊＊　0.578±0.074＊＊0.642±0.073

3.2 MDA-MB-231細(xì)胞生長曲線繪制臺盼藍(lán)染色后繪制細(xì)胞生長曲線，結(jié)果如Fig 3所示，與溶劑對照組比較，ATPR濃度越大，細(xì)胞生長曲線越低平，其中10－5mol·L－1ATPR對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用最強(qiáng)，用藥后24h開始出現(xiàn)抑制作用，并且在72 h抑制作用最明顯，說明ATPR對MDAMB-231細(xì)胞的抑制作用具有濃度－時間依賴性。

Fig 2　ATPR inhibits the half inhibition concentration(IC50)in MDA-MB-231 cells(±s，n =3)

Fig 3　Growth curves of MDA-MB-231 cells treated with ATPR(±s，n =3)＊＊P＜0. 01 vs the solvent group.

2.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察不同濃度ATPR作用后，MDA-MB-231細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化如Fig 4所示，正常組細(xì)胞生長密度大，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，ATPR用藥后細(xì)胞生長密度降低，核質(zhì)比降低，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞形態(tài)隨藥物濃度增加改變越明顯。

2.4分化標(biāo)志物MUC-1的檢測ATPR作用后觀察MDA-MB-231細(xì)胞上清中MUC-1的變化，結(jié)果如Tab 3所示，與溶劑對照組相比，MUC-1含量隨ATPR濃度的升高而下降，ATPR濃度為10－5mol·L－1時MUC-1含量下降最明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 MDA-MB-231細(xì)胞周期變化如Fig 5所示，F(xiàn)CM檢測細(xì)胞周期顯示，與溶劑對照組相比，ATRA(10－5mol·L－1)和ATPR(10－5、10－6mol·L－1)用藥后，G0/G1期細(xì)胞百分比上升，S期細(xì)胞百分比下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0. 05); G2/M期細(xì)胞改變不明顯。結(jié)果表明ATPR影響MDA-MB-231細(xì)胞周期，將細(xì)胞阻滯在G0/G1期。

Fig 4　Effect of ATPR on the morphological changes of MDA-MB-231 cells after 72h(400×)1: Control;2: Solvent;3: ATPR(10－5mol·L－1);4: ATPR(10－6mol·L－1); 5: ATPR(10－7mol·L－1); 6: ATPR(10－8mol·L－1); 7: ATPR(10－9mol·L－1);8: ATRA(10－5mol·L－1).

Fig 5　Change of cell cycle distribution of MDA-MB-231 cells treated with ATPR(n =3，±s)1: Control;2: Solvent;3: ATPR(10－5mol·L－1);4: ATPR(10－6mol·L－1);5: ATPR(10－7mol/L);6: ATPR(10－8mol·L－1);7: ATPR(10－9mol·L－1);8: ATRA(10－5mol·L－1)，*P＜0.05，＊＊P＜0. 01 vs the solvent group.

Tab 3　Effect of ATPR on the concentration of mucin 1(MUC-1)(±s，n =3)

Tab 3　Effect of ATPR on the concentration of mucin 1(MUC-1)(±s，n =3)

*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs the solvent group.

Group 　Concentration/mol·L－1　MUC-1/kU·L－1Control　?。?1.49±1.66 Solvent　　－　61.00±1.28 ATPR　10－5　43.87±1.37＊＊10－6　51.31±2.22*10－7　54.08±3.39 10－8　57.55±3.59 10－9　59.47±1.48 ATRA　10－5　44.08±2.25

2.6 RARα、RARβ、RARγ、RXRα、RXRβ、RXRγ mRNA的表達(dá)結(jié)果如Fig 6所示，與溶劑對照組相比，ATPR(10－5mol·L－1)作用后，RARα、RARβ mRNA表達(dá)無明顯變化，RARγ mRNA表達(dá)下降，RXRα、RXRβ、RXRγ mRNA表達(dá)無明顯變化。提示ATPR用藥后MDA-MB-231細(xì)胞RARγ mRNA表達(dá)下降。

2.7 RARα、RARβ、RARγ、RXRα、RXRβ、RXRγ蛋白的表達(dá)結(jié)果如Fig 7所示，與溶劑對照組相比，ATPR(10－5mol·L－1)作用后，RARα、RARβ蛋白表達(dá)無明顯變化，RARγ蛋白表達(dá)下降，RXRα、RXRβ、RXRγ蛋白表達(dá)無明顯變化。提示ATPR用藥后MDA-MB-231細(xì)胞RARγ蛋白表達(dá)下降。

3　討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，目前對乳腺癌的治療手段包括手術(shù)治療、全身化療、放射治療及內(nèi)分泌治療等［9］。放化療通常不具有選擇性，既能殺死腫瘤細(xì)胞，又殺死了大量的正常細(xì)胞。20世紀(jì)80年代Sachs［10］發(fā)現(xiàn)在一些抑制增殖和誘導(dǎo)分化的物質(zhì)作用下，小鼠白血病細(xì)胞系的異常分化是可逆的，由此提出了誘導(dǎo)分化治療的概念。誘導(dǎo)分化治療的基本特點(diǎn)是不直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而是誘導(dǎo)其分化為正?；蚪咏５募?xì)胞，減慢腫瘤細(xì)胞增殖速度，最終使惡性腫瘤緩解，從而避免常規(guī)放、化療所引起的骨髓抑制、免疫抑制等毒副作用［11］。全反式維甲酸作為經(jīng)典的誘導(dǎo)分化劑，已廣泛應(yīng)用于急性早幼粒白血病的臨床治療，但ATRA存在一系列的問題，如維甲酸綜合征耐藥等影響其療效，本課題組以ATRA為先導(dǎo)化合物，合成的維甲酸衍生物ATPR對多種腫瘤細(xì)胞株具有抑制增殖誘導(dǎo)分化作用，前期研究發(fā)現(xiàn)，ATPR對雌激素受體陽性人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7具有誘導(dǎo)分化作用，本實(shí)驗(yàn)探討在雌激素受體陰性人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231上，ATPR對其是否具有誘導(dǎo)分化作用?實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ATPR抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖存在濃度－時間依賴性行為。

Fig 6　Effect of ATPR on the mRNA expression of retinoic acid receptors(RARs)and Retinoid X acid receptor(RXRs)in MDAMB-231 cells(n =3，±s)1: Control; 2: Solvent; 3: ATRA(10－5mol·L－1); 4: ATPR(10－5mol·L－1).＊＊P＜0. 01 vs the solvent group.

Fig 7　Effect of ATPR on the proteins expression of retinoic acid receptors(RARs)and retinoid X receptors(RXRs)in MDA-MB-231 cells(n =3，±s)1: Control;2: Solvent; 3: ATRA(10－5mol·L－1); 4: ATPR(10－5mol·L－1).＊＊P＜0. 01 vs the solvent group.

細(xì)胞分化主要表現(xiàn)在形態(tài)和功能兩個方面，形態(tài)分化是細(xì)胞分化的基本特征。瑞氏－吉姆薩染色結(jié)果顯示，MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)ATPR處理后形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞生長密度下降，核質(zhì)比降低。MUC-1是一種在上皮性腫瘤高度或異常表達(dá)的膜糖蛋白，常作為乳腺癌細(xì)胞分化程度的一個重要指標(biāo)［12］。研究發(fā)現(xiàn)，ATPR作用后，MDA-MB-231細(xì)胞分泌MUC-1含量為(43. 87±1. 37)kU·L－1，較溶劑對照組(61. 00±1. 28)kU·L－1差異有顯著性。細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變和分化標(biāo)志物MUC-1含量的變化都說明ATPR對MDA-MB-231細(xì)胞具有誘導(dǎo)分化作用。

腫瘤細(xì)胞的周期學(xué)特點(diǎn)是細(xì)胞群體主要分布于DNA合成活躍S期，而分化細(xì)胞群體主要分布于DNA合成靜止的G1/G0期。因此細(xì)胞周期不可逆的阻滯于G0/G1期是細(xì)胞分化的重要特征。本研究結(jié)果顯示，MDA-MB-231細(xì)胞周期發(fā)生明顯改變，G0/G1期的細(xì)胞比例增多，S期細(xì)胞比例下降，呈明顯的G0/G1期阻滯。說明ATPR可以調(diào)控MDAMB-231細(xì)胞周期，將其阻滯在G0/G1期比例升高，具有誘導(dǎo)分化效果。

維甲酸受體屬于核受體超家族中的一個子家族，在這個超家族中還包括甾體類、維生素D和甲狀腺激素受體及過氧化物酶體增殖物激活受體、昆蟲脫皮類固醇受體和許多尚未知其配體的孤兒受體。Ayaori等［13］研究表明，維甲酸類化合物如ATRA、9cis RA首先通過與細(xì)胞質(zhì)的維甲酸結(jié)合蛋白Ⅰ、Ⅱ(CRABPⅠ、CRABPⅡ)結(jié)合，轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，與核受體RARs和RXRs形成的同/異二聚體結(jié)合，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞生長、分化以及凋亡等調(diào)節(jié)作用。維甲酸受體子家族包括: RARs和RXRs，分別有α、β、γ 3種亞型。有文獻(xiàn)指出在激素依賴性和非激素依賴性乳腺癌中，維甲酸作用后，維甲酸受體表達(dá)各不相同，在MDA-MB-231細(xì)胞中RARα、RXRα的表達(dá)非常低［14］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ATPR抑制MCF-7細(xì)胞增殖過程中，維甲酸受體RARs、雌激素受體ERs的表達(dá)發(fā)生變化。根據(jù)這一現(xiàn)象我們探討維甲酸受體在ATPR對MDA-MB-231細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程發(fā)揮怎樣的變化? q-PCR和Western blot結(jié)果表明與溶劑對照組相比，ATPR用藥后，RARγ的表達(dá)降低，RARα、RARβ、RXRα、RXRβ和RXRγ表達(dá)無明顯變化。上述結(jié)果提示，ATPR對MDA-MB-231細(xì)胞中不同的維甲酸受體表達(dá)的影響是不同的，與文獻(xiàn)的研究結(jié)果一致［14］。

(本實(shí)驗(yàn)在安徽省天然藥物活性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，衷心感謝導(dǎo)師陳飛虎教授對我的課題悉心指導(dǎo)，感謝葛金芳老師在我實(shí)驗(yàn)遇到困難時耐心解答，感謝實(shí)驗(yàn)室的同學(xué)們在實(shí)驗(yàn)期間對我實(shí)驗(yàn)技術(shù)的幫助，最后感謝母校安徽醫(yī)科大學(xué)給我提供良好的學(xué)習(xí)環(huán)境。)

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Inducing effect of 4-Amino-2-Trifluoromethyl-Phenyl Retinate on differentiation of human breast cancer MDA-MB-231 cell and its possible mechanisms

LEI Jing，CHEN Fei-hu，GE Jin-fang，LI Yue，GAO Wen-fan，DENG Zi-yun
(School of Pharmacy，Anhui Medical University，Hefei 230032，China)

Abstract:Aim To investigate the effect of 4-Amino- 2-Trifluoromethyl-Phenyl Retinate on human breastcancer cells MDA-MB-231 and the possible mechanisms.Method Human breast cancer MDA-MB-231cells were incubated with different concentrations of ATPR in vitro.MTT assay was performed to measure the proliferation of MDA-MB-231.Cell growth curves were made by counting cells and morphologic changes were observed by Wright-Giemsa staining.The differentiation marker mucin-1(MUC-1)was measured by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).Cell cycle was examined by Flow cytometry(FCM).The expression of retinoic acid receptors(RARs)and retinoid X receptors(RXRs)were detected by Western blot and Quantitative real-time PCR(q-RT-PCR)，respectively.Results Compared with solvent group，ATPR could inhibit the proliferation of MDA-MB-231 cells in a time-and dose dependent manner and induce the maturing and normality of morphology.The express of MUC-1 was significantly decreased，and the progres of cell cycle was blocked in the G0/G1-phase.The expression of RARγ was decreased.Conclusions ATPR could inhibit proliferation and induce differention of MDA-MB-231cells，it's associated with RARγ.

Key words:ATRA; ATPR; differentiation; MDA-MB-231cells; RARs; RXRs; ERs

作者簡介:雷靜(1988－)，女，碩士生，研究方向:中藥藥理學(xué)，E-mail: leijing99@126.com;

基金項(xiàng)目:國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(No 2011ZX09401)

收稿日期:2015－03－14，修回日期:2015－04－07

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－1978(2015)07－0973－07

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.017