董 坡， 代應貴， 尹邦一

(貴州大學 動物科學學院， 貴州 貴陽 550025)

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長脂擬鲿種群Cytb基因序列的變異及遺傳多樣性

董 坡， 代應貴*， 尹邦一

(貴州大學 動物科學學院， 貴州 貴陽 550025)

為給長脂擬鲿(Pseudobagrusadiposalis)的保護和利用提供科學依據，以采自珠江水系西江支流漓江、長江水系沅江上游支流氵舞陽河的長脂擬鲿各30尾為材料，研究該種魚類種群細胞色素b(Cytb)基因序列變異及遺傳多樣性。結果表明：長脂擬鲿Cytb基因序列長1 096 bp。其中，氵舞陽河種群、漓江種群分別有6個和40個變異位點，分屬6個和4個單倍型，單倍型多樣性指數(Hd)分別為0.639和0.251，單倍型間平均遺傳距離(P)分別為0.002 0和0.024 3，核苷酸多樣性(Pi)分別為0.000 80和0.006 31。氵舞陽河種群Cytb基因序列有4個同義突變和2個非同義突變，漓江種群有37個同義突變和3個非同義突變。漓江與氵舞陽河種群Cytb基因序列共定義了10種單倍型，Hd為0.727，P為0.030 0，Pi為0.026 03。2個種群間的遺傳分化指數(Fst)為0.817，基因交流值(Nm)為0.06。2個種群間出現了一定程度的分化，但未達到種群水平。

長脂擬鲿； 氵舞陽河； 漓江； Cyt b； 遺傳多樣性

長脂擬鲿(Pseudobagrusadiposalis)隸屬鲇形目鲿科擬鲿屬，主要分布于珠江水系西江、長江水系沅江以及臺灣淡水河等[1-4]，是一種小型淡水經濟魚類。近年來，由于酷魚濫捕、水域污染以及大量水壩的修建，該種魚的自然分布區(qū)逐漸縮小，種群資源量急劇減少。線粒體DNA ( Mitochondrial DNA，MtDNA) 具有母性遺傳、進化速度快、核苷酸替代率高等特點，已成為魚類進化生物學和種群遺傳學研究的重要遺傳標記[5-6]。細胞色素b(Cytb)基因是MtDNA 上的蛋白質編碼基因，其進化速度適中，適合種群水平差異的檢測，是探討種間和種內遺傳分化程度的良好標記[7-9]。到目前為止，有關長脂擬鲿的研究大多局限于形態(tài)分類和地理分布方面；此外，Katsutoshi Watanabe等[10]通過MtDNA對長脂擬鲿和烏蘇里擬鲿(Pseudobagmsussuriensis)進行了分類學上的比較分析；而基于MtDNA的長脂擬鲿種群遺傳多樣性研究未見報道。為此，筆者對長江水系沅江上游、珠江水系西江各30尾長脂擬鲿MtDNACytb基因序列進行擴增和測序，分析該種群Cytb基因序列的變異及遺傳多樣性，以期為其保護和利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 長脂擬鲿

長脂擬鲿樣品分別于2014年5月和10月采自長江水系沅江上游支流的氵舞陽河和珠江水系西江的漓江，各隨機采集30尾活魚進行解剖，取背部肌肉3～5 g用無水酒精保存，帶回實驗室于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總DNA的提取

每尾長脂擬鲿取肌肉樣品約30 mg，采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取總DNA。

1.3 PCR擴增及測序

參照文獻[11]設計Cytb基因特異性引物，L14724：5’-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3’，H15915：5’-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3’，引物由上海生物工程股份有限公司合成。PCR擴增反應總體系為30 μL，其中，2×Master Mix 15 μL、上下引物各2.4 μL、ddH2O 7.2 μL 和模板3 μL。Cytb基因PCR擴增條件為94℃預變性5 min；94℃變性45 s，61℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。

擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA純化試劑盒純化目的片段，并將目的片段送北京諾賽基因組研究中心有限公司進行雙向測序。

1.4 數據處理

采用SeqMan、Clustalx(2.0)和MEGA(5.05)軟件對所測序列進行對比排列，校準DNA序列的一致性。用MEGA(5.05)分子進化遺傳分析軟件計算堿基組成、核苷酸差異、序列差異。采用DNASP(5.10)計算遺傳多樣性參數。

從GenBank中下載細體擬鲿(Pseudobagruspratti) 的同源序列(GenBank 登錄號:AY912410.1) 并以其作為外群，根據Kimura雙參數法計算氵舞陽河種群、漓江種群單倍型間的遺傳距離，并構建長脂擬鲿單倍型的UPGMA分子系統(tǒng)樹。

2 結果與分析

2.1Cytb基因的PCR擴增

從圖1看出，長脂擬鲿Cytb基因PCR 擴增的目的DNA 片段長度約1 200 bp，條帶單一、清晰、明亮，未發(fā)現非特異性條帶，空白對照未出現擴增產物，表明無外源DNA干擾，可用于后續(xù)試驗。

注：M為DNA 分子量標準，泳道1～22為長脂擬鲿樣品，對照為空白。

2.2 基因序列變異和氨基酸變異

對照烏蘇里擬鲿Cytb基因的核苷酸全序列及其編碼的氨基酸全序列(GenBank登錄號:NC 020344.1)，去掉長脂擬鲿Cytb基因的核苷酸序列中測序反應信號不穩(wěn)定的前端24個堿基、末端18個堿基的序列，得到長脂擬鲿種群長度為1 096 bp 的Cytb基因序列及其編碼365個氨基酸的序列。

2.2.1Cytb基因序列變異 氵舞陽河種群Cytb基因序列中堿基A、T、C、G 的平均含量分別為27.9%、30.3%、27.2%和14.6%(表1)，A+T的含量高于G+C。漓江種群堿基A、T、C、G 的平均含量分別為28.3%、30.2%、27.2%、14.3%，A+T的含量高于G+C。

在長脂擬鲿Cytb基因中，3位密碼子堿基的使用頻率存在較大差異(表1)，在密碼子第1位上，各堿基的使用頻率接近；在密碼子第2位上，以堿基T的使用頻率最高，堿基G最低；在密碼子第3位上，以堿基A的使用頻率最高，堿基G最低。

表1 長脂擬鲿種群Cyt b基因密碼子的核苷酸堿基組成

表2 長脂擬鲿種群Cyt b基因單倍型及序列變異位點

在氵舞陽河種群30尾長脂擬鲿Cytb基因序列中共發(fā)現6個變異位點(表2)，分別為171、552、642、748、768和1 063，變異位點數占總位點數的0.55%。其中，簡約信息位點2個，位置為171和1 063；單變異位點4個，包括552、642、748和768。轉換位點4個，包括A-G轉換位點171和1 063，T-C轉換位點642和768；顛換位點2個，包括A-C顛換位點552和G-T顛換位點748。轉換與顛換位點數比(TS/TV)為2∶1。

在漓江種群30尾長脂擬鲿Cytb基因序列中共發(fā)現40個變異位點(表2)，變異位點數占總位點數的3.65%。其中，簡約信息位點36個，單變異位點4個；轉換位點33個，顛換位點7個。轉換與顛換位點數比(TS/TV)為33∶7。

2.2.2Cytb基因氨基酸變異 在長脂擬鲿Cytb基因序列編碼365個氨基酸組成的序列中，氵舞陽河種群共有2個氨基酸發(fā)生變化，分別是第250位丙氨酸Ala(GCU)變成絲氨酸Ser(UCU)、第355位纈氨酸Val(GUC)變?yōu)楫惲涟彼酙le(AUC)。漓江種群有3個氨基酸發(fā)生變化，分別是第30位異亮氨酸Ile(AUU)變?yōu)榱涟彼酟eu(CUU)、37位纈氨酸Val(GUA)變?yōu)楫惲涟彼酙le(AUA)和355位異亮氨酸Ile(AUC)變?yōu)槔i氨酸Val(GUC)。

結合核苷酸序列和氨基酸序列分析表明，氵舞陽河種群748(G-T)、1063(A-G)和漓江種群88(A-C)、109(G-A)、1063(A-G)改變的堿基位于密碼子第1位上，使氨基酸種類發(fā)生改變，屬于非同義突變；氵舞陽河種群的其他4個變異位點和漓江種群的其他37個位點，沒有改變氨基酸種類，屬于同義突變。

2.3 遺傳多樣性

氵舞陽河種群、漓江種群分別有6個和40個變異位點，分屬6個和4個單倍型(表2)，單倍型多樣性指數(Hd)分別為0.639和0.251，單倍型間平均遺傳距離(P)分別為0.002 0和0.024 3，核苷酸多樣性(Pi)分別為0.000 80和0.006 31。漓江種群和氵舞陽河種群Cytb基因序列共定義了10種單倍型，Hd為0.727，P為0.030 0，Pi為0.026 03。2個種群間的遺傳分化指數(Fst)為0.817，基因交流值(Nm)為0.06。

從圖2看出，10個單倍型分為2個分支，其中一個分支包括6個單倍型，代表30個個體，均為氵舞陽河個體；另一分支有4個單倍型，代表30個個體，均為漓江個體。

注：節(jié)點處數字為Bootstrap值，重復次數為1 000次。

3 結論與討論

3.1 長脂擬鲿Cytb基因的堿基組成特征

長脂擬鲿氵舞陽河種群和漓江種群Cytb基因序列中A+T均高于 C+G，與劉煥章[12]關于魚類MtDNA的研究結果相似，符合脊椎動物MtDNA堿基組成的特點[9]。Martin A P等[13]對鯊魚(Sharks)線粒體DNA研究表明，在Cytb基因密碼子不同部位存在明顯的核苷酸差異，在密碼子第1位，4種核苷酸的比例幾乎相同；在密碼子第2位，G的頻率最低(12.8%～13.9%)；在密碼子第3位，也以G的頻率最低(1.0%～5.0%)。與長脂擬鲿氵舞陽河種群和漓江種群Cytb基因密碼子堿基頻率一致。長脂擬鲿Cytb基因密碼子第2、第3位堿基頻率的差異，可能源于2個位點受到的自然選擇壓力較小[14]；其差異性表明，線粒體基因組核苷酸組成具有不均一性，與Meyer A[14]的研究結論一致。

長脂擬鲿氵舞陽河種群和漓江種群Cytb基因序列發(fā)生轉換與顛換位點數的比值(TS/TV)分別為2∶1和33∶7；轉換位點數多于顛換，符合在線粒體基因組DNA 進化過程中通常發(fā)生轉換頻率高于顛換的規(guī)律。

3.2 長脂擬鲿Cytb基因密碼子的變異

在長脂擬鲿漓江種群和氵舞陽河種群Cytb基因序列中，同義突變位點均多于非同義突變位點。Meyer A[14]認為， 密碼子第3位點由于很少導致氨基酸替代(同義替代)，其突變的積累比導致氨基酸替代的突變(非同義替代)快得多，而且在突變中，密碼子第3位點上的轉換最為常見，其次是密碼子第3位點上的顛換及密碼子第1位點上的轉換。氵舞陽河、漓江種群分別有66.7%和77.5%核苷酸突變發(fā)生在密碼子第3位上，密碼子第1位點上的突變分別僅占33.3%和22.5%，均未檢測到密碼子第2位點的堿基變異，與Meyer A[14]的研究結果一致。

3.3 長脂擬鲿種群內的遺傳多樣性

核苷酸多樣性(Pi)是衡量一個種群MtDNA 遺傳變異程度的指標。由于Pi值考慮各種MtDNA 單倍型在種群中所占的比例，因此在反映一個種群MtDNA 的多態(tài)程度時比單純的遺傳距離平均值更精確[15]。當Pi值在0.001 5～0.004 7時，種群的遺傳多樣性較低[16]。長脂擬鲿氵舞陽河種群、漓江種群Cytb基因的核苷酸多樣性(Pi)分別為0.000 80和0.006 31，表明，長脂擬鲿氵舞陽河種群的遺傳多樣性較低，而漓江種群遺傳多樣性相對較高。

長脂擬鲿氵舞陽河種群的單倍型數和單倍型多樣性指數(Hd)均高于漓江種群。氵舞陽河種群具有高單倍型多樣性(0.639)、低核苷酸多樣性(0.000 80)的特點，推測該群曾遭受過嚴重的瓶頸效應，說明長脂擬鲿氵舞陽河種群原先是由一個相對較小的有效種群迅速增長而來，通過變異積累了單倍型多態(tài)性，但卻還沒能來得及積累核苷酸多樣性[17]。漓江種群核苷酸多樣性雖然較高，但其單倍型數和單倍型多樣性均低于氵舞陽河種群，其原因可能是由于長脂擬鲿漓江種群的數量急劇減少導致基因丟失，進而使其單倍型數減少。

3.4 長脂擬鲿種群間的遺傳差異

氵舞陽河種群和漓江種群共60尾長脂擬鲿MtDNACytb基因的核苷酸多樣性(Pi)為0.026 03，遠遠大于小口白甲魚都柳江種群(0.004 7)[16]，表明氵舞陽河種群和漓江種群間的遺傳多樣性較高。2個種群內的核苷酸多樣性(Pi)遠遠小于核苷酸多樣性(Pi)；系統(tǒng)樹中氵舞陽河種群的6個單倍型聚為一支，漓江種群的4個單倍型聚為另一支，表明2個種群間存在一定程度的分化。

遺傳分化指數(Fst)表示2 個種群間的遺傳分化程度，數值在0 ～1，Fst越大，表明2個種群的分化程度越高。基因交流值(Nm)表示種群間的基因交流程度，Nm>1表明2個種群間有基因交流，Nm<1 則可能預示著隔離的產生[18]。長脂擬鲿氵舞陽河和漓江種群間具有較大的Fst(0.817)和較小的Nm(0.06)，表明2個種群間有一定程度的遺傳分化，幾乎沒有基因交流。

魚類在屬、種和種群三級水平上的遺傳距離(P)值分別為0.9、0.30和0.05[16]。長脂擬鲿氵舞陽河種群和漓江種群間Cytb基因序列單倍型間的平均遺傳距離(P)為0.030 0，小于0.05，表明2個種群間分化尚未達到種群水平。

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(責任編輯： 馮 衛(wèi))

Sequence Variation and Genetic Diversity ofCytbGene in the Population ofPseudobagrusadiposalis

DONG Po， DAI Yinggui*， YIN Bangyi

(CollegeofAnimalSciences，GuizhouUniversity，Guiyang,Guizhou550025,China)

To supply a scientific basis for the resource protection and utilization ofP.adiposalis, according to 30 individuals of the species collected from Wuyang River which is a tributary of the upper Yuanjiang River (located in the Yangtze River system) and 30 ones from the Lijiang River belonging to the Xijiang River (located in the Pearl River system)，the sequence variation and genetic diversity ofCytbgene inP.adiposalispopulation were studied for the first time. Results: 1 096 bp ofCytbgene sequence in the species was obtained. A total of six and forty variable loci were detected respectively in Wuyang River and Lijiang River. Six and four haplotypes were respectively diagnosed，the haplotype diversity(Hd)was 0.639 and 0.251 respectively，the average genetic distance(P)between the haplotypes was respectively 0.002 0 and 0.024 3，and the nucleotide diversity(Pi)was 0.000 80 and 0.006 31 respectively. There were four synonymous mutations sites and two non-synonymous mutations sites in theCytbgene of the individuals from the Wuyang River,and 37 synonymous mutations sites and three non-synonymous mutations sites in theCytbgene of the specimen from the Lijiang River. According to the 60 individuals ofP.adiposalis,a total of 10 haplotypes were diagnosed，the haplotype diversity(Hd)was 0.727，the average genetic distance(P)between the haplotypes was 0.030 0,and the nucleotide diversity(Pi)was 0.026 03.Fstvalue andNmvalue between the two populations were 0.817 and 0.06 respectively. The population ofP.adiposalisfrom the Wuyang River showed some differentiation from that in the Lijiang River，but both still belonged to the same population.

Pseudobagrusadiposalis；Wuyang River；Lijiang River；Cytb；genetic diversity

2015-01-26； 2015-04-20修回

貴州省留學人員科技活動項目 [黔人項目資助合同(2013)10]

董 坡(1988-)，男，在讀碩士，研究方向：水產動物遺傳育種與種質資源學。E-mail: dopo4108@163.com

*通訊作者：代應貴(1968-)，男，教授，從事魚類學、漁業(yè)資源與環(huán)境研究。E-mail: daiygui@163.com

1001-3601(2015)06-0321-0138-05

S917

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