高占軍，張星亮，張 穎，李旭明，許慶方，高文俊，佟莉蓉

（1.山西農業(yè)大學動物科技學院，山西 太谷 030801；2.中國畜牧業(yè)協會，北京 100028））

我國是鹽漬土地面積大，危害較嚴重的國家之一［1］，1億hm2耕地中約有700萬hm2鹽堿地［2］。近年來，隨著化肥用量的增加，土壤發(fā)生次生鹽漬化，加之對土壤的不科學管理，常年積累，次生鹽漬化越來越重，對農業(yè)生產造成很大的影響［3－5］。在農業(yè)結構調整中，牧草生產越來越受到人們的重視，利用鹽漬土資源進行牧草生產，將鹽漬土改良和利用與畜牧業(yè)生產結合起來，可以發(fā)揮巨大的生態(tài)效益和經濟效益。對于大多數作物，種子萌發(fā)和早期幼苗階段對環(huán)境脅迫最為敏感，都是以胚的生長為基礎，而胚的生長則是種子內部所有生理生化系統(tǒng)協調作用的結果。因此，對作物的耐鹽性研究大都在種子發(fā)芽期［6］。

白三葉（Trifolium repens）又名白花三葉草、白車軸草、荷蘭翅搖，為豆科、多年生草本植物，是一種分布最廣的優(yōu)質牧草，也是優(yōu)良的地被（草坪）植物。三葉草屬植物約有360種，其中，農業(yè)上利用價值較高的約有25種［7］。試驗探討白三葉在4個濃度鹽脅迫下的種子萌發(fā)、幼苗生長和生理特性，明確白三葉對不同濃度鹽的耐受能力，了解萌發(fā)期白三葉的耐鹽特性，為鹽堿地建植白三葉提供基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

白三葉種子由山西農業(yè)大學果樹所種子站提供。2013年5～6月將白三葉種子用NaCl處理，分設4個濃度梯度：0.20%、0.40%、0.60%、0.80%，另設蒸餾水為對照處理0.0%，每個處理3次重復。每個重復在鋪有2層滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中放置100粒種子，同時加入15 m L不同濃度的鹽溶液，將培養(yǎng)皿置于25℃的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)［8］，每天更換處理液。

1.2 測定方法

第7 d統(tǒng)計發(fā)芽勢，取10株幼芽用游標卡尺測定幼苗和根的長度。再取幼苗進行生理指標的測定。茚三酮比色法測定游離脯氨酸（Pro）的含量［9］。取幼芽樣品并加入5 m L磺基水楊酸試劑，煮沸20 min。冷卻后過濾，取濾液2 m L，加入冰醋酸和酸性茚三酮各2 m L，沸水浴中顯色30 min，冷卻后加入甲苯5 m L，搖動萃取1 h，取甲苯層D520nm測定吸光度，重復3次。

可溶性糖（WSC）的測定采用苯酚法測定［12］。稱取樣品（0.100±0.005）g，剪碎混勻置入20 m L的試管中，并加入10 m L蒸餾水，沸水浴中提取。冷卻過濾，去濾液2 m L，加入1 m L苯酚溶液，在5～20 s內再加入5 m L的濃硫酸溶液，冷卻后在485 nm波長下測定光密度，重復3次；硫代巴比妥酸發(fā)測定丙二醛（MDA）含量［10］，稱取樣品2 g，取2 m L 0.05 mol／L pH 7.8磷酸緩沖液為介質，研磨成勻漿。取提取液2 m L并加入2 m L 0.5%硫代巴比妥酸溶液煮沸10 min，冷卻后3 000 rpm下離心15 min，取上清液測定532 nm下吸光度，重復3次。

1.3 數據分析

用Excel 2007和SAS 9.2軟件對試驗數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 不同NaCl濃度對白三葉種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率的影響

鹽脅迫濃度達到0.40%時，白三葉草種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率都呈現下降的趨勢（表1）。

表1 不同NaCl濃度對白三葉種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率Table 1 Effect of different NaCl concentration onseed germination potential，germination rateof Trifolium repens

NaCl濃度處理在0.2%時，白三葉種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率均最大，分別為45%和75%，發(fā)芽率和對照組沒有顯著的差異；NaCl濃度≥0.40%時，白三葉種子的發(fā)芽率顯著低于對照（P＜0.01），而且當濃度為0.80%時只有個別發(fā)芽。在NaCl濃度≥0.40%時候發(fā)芽勢顯著低于對照，發(fā)芽勢受到抑制。

2.2 不同NaCl濃度對幼苗和根生長速度的影響

當NaCl濃度為0.20%時，不影響白三葉根和幼苗的生長；濃度為0.40%時幼苗生長受到影響、根的生長受到顯著影響；濃度＞0.60%時，幼苗和根的生長收到抑制，和對照組差異極顯著（P＜0.01）（表2）。

2.3 不同NaCl濃度對幼苗體內Pro、WSC、MDA的影響

NaCl濃度在0.20%和0.40%時Pro的含量上升梯度最大。在整個處理組的濃度梯度內，Pro的含量處于上升狀態(tài)，Pro含量在濃度為0.80%時候達到最大值（表3）；不同濃度的NaCl脅迫下WSC的變化呈現增加的趨勢，在濃度為0.2%時降到最低然后逐步增大，在濃度為0.20%～0.40%時增幅最大，當NaCl濃度＞0.40%后增大趨于緩和，當 NaCl濃度為0.80%時白三葉體內WSC含量在供試處理濃度下達到最大值；在對照組中，白三葉體內MDA含量很低；當NaCl濃度為0.20%時白三葉體內的MDA含量顯著增加（P＜0.01）；MDA含量隨著NaCl濃度的增加而增加。

表2 不同NaCl濃度下幼苗的芽長和根長Table 2 Effect of Different NaCl concentration on the seedling and root growth

表3 不同NaCl濃度對幼苗體內Pro、可溶性糖、MDA含量Table 3 Pro，soluble sugar and MDA content in the Trifoliumrepens under different NaCl concentrations

3 討論

3.1 不同濃度NaCl脅迫對白三葉種子發(fā)芽和生長的影響

鹽脅迫抑制植物的生長發(fā)育，造成植物生理代謝紊亂，不同的生育期有不同的表現形式。其中種子萌發(fā)和幼苗生長階段是牧草對鹽脅迫最敏感的時期［11］。在牧草種子萌發(fā)階段，鹽脅迫主要表現在抑制種子萌發(fā)和胚根、胚芽的生長方面。試驗表明，在NaCl脅迫下，白三葉種子萌發(fā)受到一定的影響，濃度在0.20%時發(fā)芽率達到75%，當濃度達到0.40%甚至是超過0.40%時，發(fā)芽率受到了顯著的影響，發(fā)芽率整體低于30%。因此，白三葉種子對于鹽度脅迫有一定的萌發(fā)潛力和抗鹽特性，但是過高的鹽度容易使種子生長發(fā)育受到抑制［12－14］。

3.2 不同濃度NaCl脅迫對白三葉幼苗滲透調節(jié)物質的影響

在NaCl脅迫下，有機滲透保護物質，如可溶性糖、Pro等，可以使細胞保持適當的滲透勢而防止脫水，同時對生物大分子的結構和功能起到穩(wěn)定和保護作用［15］。

Pro是植物對鹽堿脅迫反應敏感指標。植物在正常條件下，Pro含量很低，但遇到鹽堿、干旱、低溫等逆境時，Pro便會大量積累，其積累指數與植物的抗逆性有關［16，17］。試驗發(fā)現，在不同濃度的 NaCl脅迫后，Pro的含量除NaCl濃度在0.2%之外都高于對照組，且隨著濃度升高，Pro的含量逐漸增加。說明在鹽脅迫下，白三葉可通過增加體內Pro含量，來維持滲透平衡，具有一定的抗鹽性［18］。

WSC是很多非鹽生植物的主要滲透調節(jié)劑，并且是合成別的有機溶質的碳架和能量來源［19］，對細胞膜和原生質膠體亦有穩(wěn)定作用，還可以在細胞內無機離子濃度高時起到保護作用。因此，可以認為 WSC濃度的增加是白三葉對鹽分脅迫抵抗能力的一種表現方式［20］。隨著NaCl脅迫濃度增加，幼苗受到刺激開始大量積累WSC，以降低滲透勢，維持體內外滲透壓的平衡，抵抗鹽害。

3.3 不同濃度NaCl脅迫對白三葉幼苗MDA含量的影響

MDA是膜脂過氧化的重要產物，可與蛋白質、核酸、氨基酸等活性物質交聯，形成不溶性的化合物（脂褐素）沉積，干擾細胞的正常生命活動，其含量高低，反映出膜脂過氧化程度，且與植株受脅迫程度密切相關［21］。白三葉幼苗在不同鹽脅迫下，MDA含量都隨著鹽濃度的增加而增加，顯示了植株體在鹽脅迫后都不同程度的受到了傷害［22］。

［1］朱興運，納森，沈禹穎，等.抗鹽牧草的研究成就與實踐［J］.草原與草坪，1994（3）：13－19.

［2］蘇加楷.中國牧草新品種選育的回顧與展望［J］.草原與草坪，2001（4）：3－8.

［3］Kenneth B M.Salinity tolerance mechanism of six C4turf grasses［J］.Journal of the American Society for Horticultural Science，1994，119（4）：779－784.

［4］Horst G L，Beadle N B.Salinity affects germination And growth of tall Fescue cultivars［J］.American Social Hot Science，1984，109（3）：419－422.

［5］趙海明，李源.不同高丹草品種發(fā)芽期NaCl脅迫評價研究［J］.草原與草坪，2012，32（3）：26－36.

［6］韓瑞宏，李志丹，高桂娟.鹽脅迫對熱研2號柱花草種子萌發(fā)的影響［J］.草原與草坪，2014，34（5）：16－20.

［7］樊錦春，劉以信.草莓三葉草的利用與栽培［J］.特種經濟動植物，2003，6（3）：29.

［8］彭清青，宋梅玲.不同酸堿條件下內生真菌對三種禾草種子萌發(fā)的影響［J］.草業(yè)學報，2011，20（5），72－78.

［9］中科院上海生命科學院植物生理生態(tài)研究所.現代植物生理實驗指南［M］.北京：中國科技出版社，1998：128－145.

［10］喬富廉.植物生理學實驗分析測定技術［M］.北京：中國農業(yè)科學出版社，2002.

［11］Xu X Y，Fang R，Zhang R，et al Proteomic analysis of seed germination under salt stress in soybeads［J］.Joumal of Zhejiang University Science B：Biomedicine ＆ Biotechnology，2011，12（7），507－517.

［12］穆延召，彭云玲，李玥，等.NaCl脅迫對玉米雜交種子萌發(fā)的影響［J］.甘肅農業(yè)大學學報，2013，48（6）：40－44.

［13］Greenway H，Munns R.Mechanism’s of salt tolerance in nonhalophytes［J］.Annual Review of Plant Physilogy，1980，31：149－190.

［14］Ali A，Tucher T C，Thompson T L，et al.Effects of salinity and mixed ammionum and nitrate nutrition on the growth and nitrogen utilizationof barely［J］.Journal of Agronomy and Crop Science，2001，186：223－228.

［15］Watad A A，Reinhold L，Lerner H R.Comparison between a stable NaCl－selected Nicotinana cell line and wild type［J］.Plant Physiology，1983，73：624－632.

［16］馬宗仁，郭博.短芒披堿草和老芒麥在水分脅迫下游離脯氨酸積累的研究—植物的抗旱性與脯氨酸積累能力關系的標準［J］.中國草地，1991（4）：12－16.

［17］趙可夫，范海.鹽脅迫下真鹽生植物與泌鹽植物的滲透調節(jié)物質及其貢獻的比較研究［J］.應用與環(huán)境生物學報，2000，6（2）：99－105.

［18］袁琳，克熱木·伊力.鹽脅迫對阿月渾子可溶性糖、淀粉、脯氨酸含量的影響［J］.新疆農業(yè)大學學報，2004，27（2）：19－23.

［19］王愛國.丙二醛作為脂質過氧化指標的探討［J］.植物生理學通訊，1986（2）：55－57.

［20］儲玲，劉登義，王友保，等.銅污染對三葉草幼苗生長及活性氧代謝影響的研究［J］.應用生態(tài)學報，2004，15（1）：119－122.

［21］Yu Y S，Yun L S，Guo Y.Effects of salinity on germination of six forage species and their recovery from saline conditions［J］.New Zealand Journal of Agricultural Research，2003，46：263－269.

［22］吳銀明，王平，劉洪升，等.NaCl分根脅迫對羊草幼苗生長及其生理生化特性的影響［J］.西北植物學報，2007，27（9）：1807－1813