李 辰，趙 燕，巫瑩柱，劉秋小，何雪清

(1.五邑大學(xué)分析測試中心，廣東江門 529020；2.五邑大學(xué)紡織服裝學(xué)院，廣東江門 529020)

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應(yīng)用混合樹脂技術(shù)從蛹蟲草中提取純化蟲草素

李 辰1，趙 燕1，巫瑩柱2，劉秋小1，何雪清1

(1.五邑大學(xué)分析測試中心，廣東江門 529020；2.五邑大學(xué)紡織服裝學(xué)院，廣東江門 529020)

[目的]應(yīng)用混合樹脂技術(shù)從蛹蟲草中提取純化蟲草素。[方法]利用微波輔助提取法從蛹蟲草子實體或其大米培養(yǎng)殘基中提取蟲草素，利用混合大孔樹脂對蟲草提取物進行分離純化。通過比較大孔吸附樹脂和陰陽離子交換樹脂對蟲草素的靜態(tài)吸附和解吸，以吸附量和解吸附率為評價指標(biāo)，從11種商品化樹脂中篩選出較佳樹脂，進一步進行樹脂混合比例的靜態(tài)吸附試驗，篩選出較佳的干樹脂質(zhì)量比，按此比例在樹脂柱中設(shè)計了幾種不同的填裝混合方式進行動態(tài)吸附和解吸。[結(jié)果]試驗篩選出LSA-21、XAD-16、LX-28 3種大孔吸附樹脂為較佳樹脂，進行靜態(tài)吸附試驗時三者較佳的干樹脂質(zhì)量比為1∶1∶1。將XAD-16、LX-28、LSA-21 3種樹脂按由上至下分層填裝的方式進行動態(tài)吸附和解吸附效果較好，應(yīng)用該混合樹脂床進行一次動態(tài)吸附和解吸附后，解吸液浸膏中蟲草素的含量由原生藥中的0.442%提高至23.600%。[結(jié)論] 該方法可應(yīng)用于蛹蟲草子實體或其培養(yǎng)殘基中蟲草素的提取純化。

蛹蟲草；純化；混合樹脂

近年來，國內(nèi)外市場對野生冬蟲夏草的需求越來越大，導(dǎo)致野生蟲草過度采挖而變得十分稀缺昂貴。作為野生蟲草的替代品，蛹蟲草子實體的相關(guān)研究受到學(xué)者的關(guān)注。蛹蟲草子實體為麥角菌科蟲草屬真菌蛹草菌(CordycepsmilitarisLink)的干燥子座，富含多種營養(yǎng)及藥用成分，如腺苷、蟲草素、SOD酶、粗多糖和蛋白質(zhì)等，有“甘平保肺、益腎、補精髓、止血化痰”等療效[1]。近年來，由于人們生活水平的不斷提高和對健康的日益關(guān)注，蛹蟲草及其相關(guān)功能食品、保健食品和藥品的市場需求愈來愈大。人們對蛹蟲草的人工培養(yǎng)[2]、提取純化[3-6]、分析質(zhì)控[7-8]以及開發(fā)應(yīng)用等方面進行了深入的研究，并取得一定成果。大孔吸附樹脂和離子交換樹脂自20世紀(jì)70年代末開始應(yīng)用于中草藥化學(xué)成分的提取分離，我國主要用于醫(yī)藥工業(yè)、天然活性物質(zhì)的提純和中草藥有效成分的分離純化。不同品種性質(zhì)的樹脂，因其具有不同的功能基團，比表面積、孔徑、孔容等樹脂結(jié)構(gòu)也可能不同，故其具有不同的吸附及解吸功能。目前已有少量應(yīng)用混合樹脂分離純化中草藥和天然產(chǎn)物有效成分的報道，如萊鮑迪苷A[9]、兩性霉素[10]、復(fù)方肝康片總黃酮[11]和桑葉多酚[12]等。筆者擬利用樹脂的這一特性，將預(yù)先篩選出的不同類型的樹脂進行適當(dāng)混合，利用混合樹脂的協(xié)同作用來分離純化蟲草素。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1原料與主要試劑。人工蛹蟲草子實體，購自廣東新會寶農(nóng)堂公司；蛹蟲草大米培養(yǎng)殘基，廣東新會農(nóng)業(yè)基地提供；子實體和培養(yǎng)殘基經(jīng)干燥粉碎后過60目篩，培養(yǎng)殘基粉碎后經(jīng)石油醚脫脂處理，回收脫脂后的固體備用。大孔吸附樹脂AB-8、D101、LSA-21、LX-28和LX-38，西安藍曉科技有限公司；大孔吸附樹脂XAD-7HP和XAD-16,美國羅門哈斯公司；離子交換樹脂001×7、D113、LSD-001、LSD-732，西安藍曉科技有限公司；60～90 ℃石油醚和95%乙醇(分析純)，汕頭西隴化工有限公司。

1.1.2主要儀器設(shè)備。 Finnigan Surveyor高效液相色譜儀，配自動進樣器、四元泵、光電二極管陣列檢測器(DAD)、色譜工作站，美國Thermo Scientific公司；WBFY 201型微波反應(yīng)器，鞏義科瑞儀器有限公司；QE-200萬能粉碎機，浙江屹立工貿(mào)有限公司；BZF50型真空干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器和SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)真空水泵，鞏義市英峪予華儀器廠；H1650高速臺式離心機，長沙湘儀離心機有限公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器，金壇市康華電子儀器制造廠；XP 205電子天平，梅特勒-托利多公司。

1.2 蟲草素分析條件按文獻[8]高效液相色譜方法，測定各提取液樣品和分離純化樣品中蟲草素的含量。色譜條件：Eclipse XDB-CN色譜柱,規(guī)格150×4.6 mm, 5 μm (Agilent公司)；柱溫30 ℃；流動相為甲醇∶水=7∶93 (V/V)；流速為1.0 ml/min；DAD光譜掃描范圍200～400 nm，定量檢測波長260 nm；進樣量5 μl。

1.3 提取方法比較

1.3.1微波提取法。稱取一定質(zhì)量脫脂后的固體培養(yǎng)基，以物料比為1∶25 g/ml(M/V)的40%乙醇溶液，于240 W下微波提取90 s，放至室溫后過濾，棄去濾渣，以95%乙醇進行醇沉，濃縮，離心，定容。同法進行微波2次和微波3次提取。

1.3.2索氏抽提法。稱取一定質(zhì)量脫脂后的固體培養(yǎng)基，以物料比1∶25 g/ml(M/V)的純水于150 ℃下恒溫抽提，直至提取液無色為止，回收提取液，棄去固體，以95%乙醇進行醇沉，濃縮，離心，定容。

1.3.3水熱回流法。稱取一定質(zhì)量脫脂后的固體培養(yǎng)基，以物料比1∶25 g/ml(M/V)的比例加入純水后，置回流冷凝裝置中，于70 ℃下恒溫攪拌提取2 h。提取液放至室溫后過濾，濾渣重復(fù)提取1次，合并2次濾液，棄去固體，以95%乙醇進行醇沉，濃縮，離心，定容。

1.4 樹脂預(yù)處理大孔吸附樹脂預(yù)處理：向各樹脂中加入95%乙醇溶液，浸泡24 h后，用95%乙醇進行漂洗清洗，直至取1 ml清洗液于10 ml比色管中，加入3 ml水無渾濁現(xiàn)象，則表明樹脂已清洗干凈，再用水將樹脂清洗至無醇味，抽濾至無水滴落即可。

離子交換樹脂預(yù)處理：向各供試的離子交換樹脂中加入2 mol/L NaOH溶液，浸泡2 h后以蒸餾水洗至中性，再以2 mol/L HCl溶液浸泡2 h，用蒸餾水洗至中性，再分別用堿和酸重復(fù)清洗1次即可。

1.5 靜態(tài)吸附和解吸試驗準(zhǔn)確稱取各大孔吸附樹脂(AB-8、D101、LSA-21、LX-28、LX-38、XAD-7HP和XAD-16)和離子交換樹脂(001×7、D113、LSD-001和LSD-732)，每份稱量濕樹脂2 g，精密稱定，分別置250 ml 具塞錐形瓶中，加入一定質(zhì)量濃度的蟲草素提取液30 ml，于30 ℃下恒溫振蕩提取2 h，振蕩轉(zhuǎn)速為120 r/min，用HPLC測定殘余上清液中的蟲草素質(zhì)量濃度。向吸附完成后的大孔吸附樹脂中加入25%乙醇溶液50 ml進行靜態(tài)解吸，如為離子交換樹脂，則加入0.2 mol/L的氨性乙醇(80%，V/V)溶液50 ml，振蕩解吸2 h，振蕩器轉(zhuǎn)速120 r/min，用HPLC測定解吸液中蟲草素的質(zhì)量濃度。

式(1)～(3)分別為吸附樹脂對蟲草素吸附量(mg/g干樹脂)、吸附率(%)和解吸率(%)的計算公式，通過比較各樹脂的吸附量和解吸率，篩選出對蟲草素吸附量和洗脫率均較高的樹脂。

(1)

(2)

(3)

式中：ρ0為原液質(zhì)量濃度(mg/ml)；ρe為平衡質(zhì)量濃度(mg/ml)；ρd為解吸液質(zhì)量濃度(mg/ml)；V0為原液體積(ml)；Vd為洗脫液體積(ml)；m為干樹脂質(zhì)量(g)。

1.6 動態(tài)吸附和解吸試驗將不同填裝方式的混合大孔吸附樹脂以及最佳單一大孔吸附樹脂，分別以濕法填裝于玻璃層析柱(內(nèi)徑18 mm)中，測其樹脂床體積(BV)，將樹脂柱處理好后在柱頂端緩慢加入一定質(zhì)量濃度的蟲草素提取液，以3 BV/h流速進行吸附，分段收集流出液，以HPLC監(jiān)測流出液中蟲草素的濃度。待流出液蟲草素濃度升高至接近上柱液濃度，即達吸附飽和，用25%的乙醇進行動態(tài)解吸，洗脫流速為2 BV/h，分段收集解吸液，以HPLC監(jiān)測解吸液中蟲草素的含量，合并蟲草素含量較高的解吸液部分制備浸膏，與原料中蟲草素含量進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線精密稱取蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品2.5 mg，用超純水溶解定容于25 ml容量瓶，制成濃度為0.1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。量取標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，加超純水依次稀釋定容得蟲草素工作溶液濃度分別為0.040 00、0.016 00、0.006 40、0.002 56 mg/ml。按“1.2”方法進樣分析，以蟲草素峰面積為縱坐標(biāo)，濃度(mg/ml)為橫坐標(biāo)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=71 754x+48 922，線性相關(guān)系數(shù)R為0.999 4。

2.2 提取方法比較結(jié)果由蟲草素的結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)可知，其水溶性良好，故選用低成本綠色環(huán)保的水或低濃度的乙醇溶液作為提取溶劑。該試驗以蟲草素得率、浸膏質(zhì)量及浸膏中蟲草素的含量為提取效果的評價指標(biāo)。表1比較了微波提取、水熱回流提取和索氏抽提蟲草素的提取效果，結(jié)果表明微波提取3次較1次和2次時的蟲草素得率和浸膏中蟲草素含量下降明顯。同時，發(fā)現(xiàn)水熱回流法和索氏提取法提取蟲草素的效果也沒有微波1次和微波2次提取的效果好，絮狀物明顯增多，可能有部分多糖化合物導(dǎo)致浸膏中蟲草素的含量顯著減少。微波1次和微波2次的提取效果相當(dāng)，考慮到成本、效率，最終確定以240 W功率微波提取1次，提取90 s為好。

2.3 蛹蟲草子實體及培養(yǎng)殘基中蟲草素含量測定按“2.2”確定的微波提取1次的方法，提取蛹蟲草子實體和大米培養(yǎng)殘基中的蟲草素含量，結(jié)果列于表2。由表2可知，蛹蟲草大米培養(yǎng)殘基中也含有相當(dāng)數(shù)量的蟲草素，可加以綜合利用。

2.4 靜態(tài)吸附法篩選混合樹脂

2.4.1單一樹脂篩選。參考前期蟲草素吸附工藝條件[13]，分別向各大孔吸附樹脂和離子交換樹脂中加入質(zhì)量濃度為8.93 mg/ml的蟲草素提取液，在水浴恒溫振蕩器中振蕩吸附2 h。吸附完成后，加入25%乙醇溶液(大孔吸附樹脂)或0.2 mol/L的80%氨性乙醇溶液(離子交換樹脂)解吸，各吸附樹脂對蟲草素的吸附量、吸附率和解吸率結(jié)果列于表3。

吸附樹脂有較高的強度，密度略大于水，在有機溶劑中有一定溶脹性，有利于吸附質(zhì)的有效溶出。樹脂干燥時樹脂孔會收縮，吸附效果大為降低，故樹脂在預(yù)處理時僅將樹脂的表面結(jié)合水除去，而內(nèi)部結(jié)晶水保留。目前，多采用樹脂干重對目標(biāo)物質(zhì)的吸附量來評價和比較樹脂的吸附能力，故在試驗中對樹脂的含水率進行測定，結(jié)果列于表3，在樹脂吸附試驗稱量時均為濕樹脂的質(zhì)量，而在計算吸附量時折算為干樹脂的質(zhì)量。

表1 蟲草素提取法比較

表2 蛹蟲草大米培養(yǎng)殘基和蛹蟲草子實體中蟲草素含量比較

由表3結(jié)果可知，大孔吸附樹脂對蟲草素的吸附量和解吸率顯著高于離子交換樹脂，可能是由于大孔吸附樹脂受無機鹽類及強離子、低分子化合物存在的影響較小。盡管001×7、D113和LSD-001 3種陽離子交換樹脂對蟲草素的吸附率較高，但其吸附量較小，解吸率也非常低。LSD-732為凝膠型酸性陽離子交換樹脂，蟲草素分子不能順利進入該樹脂微孔吸附，而蟲草提取液中的小分子雜質(zhì)進入樹脂微孔后引起樹脂孔穴部分堵塞，導(dǎo)致其吸附和解吸效果均很差。

綜合比較表3各樹脂吸附量和解吸率結(jié)果可知，XAD-16的純化效果最好，LX-28次之。蟲草素為極性有機弱堿，XAD-16為中極性大孔交聯(lián)網(wǎng)格樹脂，比表面積為800 m2/g，顯著高于同為中極性的樹脂LSA-21和LX-28。盡管D101樹脂比表面積也較大(753 m2/g)，但其為非極性樹脂不具有極性的功能基。綜合比較可知，樹脂XAD-16的大孔網(wǎng)絡(luò)、高比表面和表面疏水性芳香環(huán)獨特結(jié)構(gòu)，使其對蟲草素的吸附和解吸能力較強，中極性大孔樹脂LX-28和LSA-21也含有一定極性的功能基和較適宜的物理結(jié)構(gòu)，故其吸附和解吸效果也較好。最終選定XAD-16、LX-28和LSA-21 3種樹脂為較佳的單一樹脂進行混合吸附試驗。

表3 靜態(tài)吸附和解吸試驗結(jié)果

注：“/”為生產(chǎn)廠家未提供。

2.4.2樹脂混合比例篩選。分別按樹脂干重比例為1∶1∶1、2∶1∶1、1∶2∶1和1∶1∶2(XAD-16 ∶ LSA-21 ∶ LX-28)稱取4份混合樹脂于具塞錐形瓶中，按“2.4.1”靜態(tài)吸附和解吸操作后，分別用HPLC測其吸附殘液和解吸液中蟲草素的含量，結(jié)果列于表4。由表4可知，樹脂干重比例對混合樹脂的吸附和解吸效率影響不大，以1∶1∶1干重比例混合的樹脂，其吸附量和解吸率略優(yōu)于其他混合比例的，考慮到樹脂成本和可操作性，最終確定XAD-16、LSA-21和LX-28 3種樹脂的混合比例為1∶1∶1。

表4 樹脂混合比例靜態(tài)吸附試驗結(jié)果

2.5 混合樹脂和單一樹脂的動態(tài)吸附與解吸附

2.5.1動態(tài)吸附試驗。為比較混合樹脂與單一樹脂吸附性能的差異，選擇性能最佳的XAD-16樹脂同樣進行吸附試驗，比較單一樹脂與混合樹脂的純化效果。稱取相當(dāng)于干重質(zhì)量7.5 g的混合樹脂或單一樹脂，濕法裝柱(柱內(nèi)徑為18 mm的玻璃層析柱)，向該樹脂床中緩慢加入蟲草素質(zhì)量濃度為0.013 38 mg/ml的上樣吸附液，浸泡30 min后，控制混合樹脂和單一樹脂XAD-16的吸附流速為3 BV/h，間隔一定時間取樣，以HPLC測定吸附殘液中蟲草素的含量。以蟲草素的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，以上柱吸附液體積為橫坐標(biāo)作圖(20 BV之前泄露液中未檢出蟲草素)，全混合樹脂和單一樹脂XAD-16的動態(tài)泄露曲線如圖1所示。

由圖1可知，蟲草素在混合樹脂和單一樹脂上吸附25 BV后開始出現(xiàn)泄露。單一樹脂XAD-16在45 BV時泄露基本達平衡狀態(tài)，此時泄露液中蟲草素質(zhì)量濃度為0.010 38 mg/ml，接近上柱液蟲草素質(zhì)量濃度，而全混合樹脂上柱液在44 BV時仍未達到平衡。混合樹脂和單一樹脂的填裝量均為7.5 g，由此可知，混合樹脂對蟲草素的吸附量顯著高于單一樹脂。

2.5.2動態(tài)解吸和浸膏制備?？疾鞓渲旌戏绞綄οx草素純化效果的影響，并與單一樹脂作比較。采取2種方式混合樹脂：一種是分層填裝法，考慮到各單一樹脂的吸附解吸能力大小，將吸附性能最佳的XAD-16樹脂填裝在最先接觸蟲草素吸附液的樹脂床上層，故由上到下依次分層填裝XAD-16、LX-28及LSA-21樹脂；另一種是預(yù)先將3種樹脂完全混合，再濕法填裝至層析柱。向動態(tài)吸附飽和的混合樹脂、分層樹脂及單一樹脂柱中，分別緩慢加入濃度為25%乙醇解吸液，浸泡30 min后控制解吸附流速2 BV/h進行洗脫，間隔一定時間取樣，以HPLC測定解吸液中蟲草素的質(zhì)量濃度。以解吸液中蟲草素的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，以解吸液體積為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果見圖2和圖3。

由圖2和圖3洗脫曲線可知，各種方式的洗脫曲線均基本呈高斯分布，以XAD-16單一樹脂的蟲草素洗脫分布最為集中，洗脫至10 BV時已基本到解吸終點。全混合和分層混合樹脂的解吸終點均為33 BV，全混合洗脫液峰值濃度較分層混合的高，但蟲草素在各洗脫液中的分布范圍較寬，不利于后續(xù)洗脫液的合并濃縮，在實際生產(chǎn)中也增加功耗和時間成本。分別將全混合、分層混合和XAD-16單一樹脂動態(tài)解吸液中蟲草素含量較高部分進行合并，減壓濃縮制備純化浸膏，浸膏中蟲草素的含量結(jié)果列于表5。

表5 動態(tài)解吸液純化浸膏比較

由表5浸膏結(jié)果可知，相同吸附和解吸附工藝條件下，分層混合樹脂得到的浸膏量最少僅為8.90 mg，但其解吸液合并浸膏中蟲草素的含量最高達23.600%，比全混合樹脂和XAD-16單一樹脂的純化效果好?；旌蠘渲兓x草素的效果顯著優(yōu)于最佳單一樹脂XAD-16，而分層混合樹脂的純化效果優(yōu)于全混合樹脂。這可能是由于混合樹脂網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)和功能基團的協(xié)同互補作用，使得混合樹脂比XAD-16單一樹脂的純化效果好，待后續(xù)研究優(yōu)化混合樹脂吸附工藝參數(shù)后，蟲草素純度有望進一步提高。

3 結(jié)論

通過比較混合樹脂(XAD-16、LX-28和LSA-21，樹脂干重比為1∶1∶1)及單一樹脂XAD-16動態(tài)解吸浸膏中蟲草素的含量，確定混合樹脂的純化效果明顯優(yōu)于單一樹脂，而分層混合樹脂要優(yōu)于全混合型樹脂。經(jīng)分層混合樹脂吸附純化后，浸膏中蟲草素含量由原料中的0.442%提高至23.600%，提高近53.4倍。該方法可用于蛹蟲草及其相關(guān)產(chǎn)品中蟲草素的提取純化。另外，蛹蟲草大米培養(yǎng)殘基中亦含有相當(dāng)數(shù)量的蟲草素，以各種基質(zhì)培養(yǎng)蟲草素剩余的培養(yǎng)基為提取原料，對蛹蟲草這一藥食兩用的農(nóng)產(chǎn)品資源的綜合利用，開發(fā)相關(guān)醫(yī)藥保健和功能食品具有重要意義。

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Extraction and Purification of Cordycepin fromCordycepsmilitarisby Using the Mixed Macroporous Resins

LI Chen1, ZHAO Yan1, WU Ying-zhu2et al

(1. Instrumental Analysis and Research Center, Wuyi University, Jiangmen, Guangdong 529020; 2. School of Textiles and Clothing, Wuyi University, Jiangmen, Guangdong 529020)

[Objective] To extract and purify cordycepin fromCordycepsmilitarisby using the mixed macroporous resins. [Method] The microwave assistant method was used for extracting cordycepin fromCordycepsor its deserted rice medium, and the mixed macroporous adsorption resins was adopted for purification of cordycepin. By using the macroporous resin, cation and anion exchange resin as adsorption materials, the static adsorption and desorption test of cordycepin was proceeded. With adsorption mass and desorption rate as the evaluation index, the best three resin XAD-16, LSA-21 and LX-28 were screened from eleven commercial test resins, and the mixing proportion of the three resins was further studied in static adsorption test. Screen the best weight ratio of the three selected resins, and then conduct the dynamic adsorption and desorption experiments with different packing and mixing modes. [Result] Selecting LSA-21, XAD-16, LX-28 macroporous adsorption resin to conduct static adsorption test, the optimal mass ratio is 1∶1∶1. It was found that the packing order of XAD-16, LX-28 and LSA-21 from top to bottom layer was better than others. After dynamic adsorption and desorption test on the mixed resin bed once, the content of cordycepin in desorption extractum increased from 0.442% (in raw material) to 23.600%. [Conclusion] This method could be used to extract and purify cordycepin fromCordycepsor its deserted rice medium.

Cordycepsmilitaris; Purification; Mixed resin

廣東省自然科學(xué)基金項目(S2012040007587)；廣東高校輕化工清潔生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心開放課題。

李辰(1976-)，男，甘肅蘭州人，講師，博士，從事天然產(chǎn)物分離分析及功能食品開發(fā)研究。

2014-11-13

S 567

A

0517-6611(2015)01-266-04