田志革， 柴洪亮， 華育平

(東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040)

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禽6型副粘病毒V蛋白對(duì)抗宿主細(xì)胞干擾素β的產(chǎn)生

田志革， 柴洪亮， 華育平*

(東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040)

[目的] 研究禽6型副粘病毒V蛋白對(duì)抗宿主細(xì)胞干擾素β的產(chǎn)生的機(jī)制。[方法] 構(gòu)建真核表達(dá)禽6型副粘病毒P、V、W蛋白的重組載體，分別與IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、PRDⅢ/I-Luc、AP-1-luc報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，接種仙臺(tái)病毒刺激細(xì)胞后，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)螢火蟲(chóng)熒光素酶及海腎熒光素酶活性。[結(jié)果]禽6型副粘病毒V蛋白能通過(guò)降低NF-κB的活性，進(jìn)而顯著抑制宿主細(xì)胞產(chǎn)生IFN-β。[結(jié)論]該研究初步闡明了禽6型副粘病毒V蛋白對(duì)抗宿主天然免疫的機(jī)制。

副粘病毒；V蛋白；對(duì)抗；干擾素β

當(dāng)病毒侵染宿主時(shí)，會(huì)遭受多種來(lái)自宿主的抗病毒反應(yīng)，其中干擾素(IFN)反應(yīng)在早期的天然免疫及調(diào)節(jié)獲得性免疫反應(yīng)時(shí)發(fā)揮重要的作用[1-3]。大量研究表明，大部分副粘病毒編碼特殊的附件蛋白，即由P基因編輯剪接產(chǎn)生的V或/和C蛋白，通過(guò)阻斷IFN傳導(dǎo)信號(hào)或限制宿主IFN的產(chǎn)生來(lái)規(guī)避IFN系統(tǒng)[4-9]。例如，副粘病毒科的腮腺炎病毒屬成員5型猿猴病毒(SV5)通過(guò)降解STAT1來(lái)阻斷IFN的信號(hào)傳導(dǎo)，仙臺(tái)病毒(SeV)的C蛋白發(fā)揮相似的功能。SV5及SeV的V蛋白能降低干擾素調(diào)節(jié)因子IRF-3和NF-κB的活性，從而抑制IFN-β的產(chǎn)生[10-11]。

副粘病毒P基因除了表達(dá)P蛋白外，還通過(guò)編輯剪接表達(dá)V蛋白及W蛋白。為了闡明禽6型副粘病毒對(duì)抗宿主細(xì)胞先天免疫的機(jī)制，筆者將表達(dá)P、V和W蛋白的重組質(zhì)粒與一系列報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過(guò)測(cè)定熒光素酶活性來(lái)判斷病毒蛋白對(duì)IFN-β基因的啟動(dòng)子序列的作用機(jī)制，從而對(duì)抗宿主細(xì)胞先天免疫。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1質(zhì)粒與細(xì)胞。重組質(zhì)粒pCDNA-P(flag標(biāo)簽)、pCDNA-V(flag標(biāo)簽)、pCDNA-W(flag標(biāo)簽)由筆者構(gòu)建；IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、PRDⅢ/I-Luc、AP-1-luc雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院胡曉亮博士惠贈(zèng)；HEK-293T細(xì)胞由哈爾濱獸醫(yī)研究所國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室馬病團(tuán)隊(duì)提供。

1.1.2主要試劑。Flag鼠源單抗和脂質(zhì)體Lipofectamine 2000均購(gòu)自Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；DyLight800標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自KPL公司；雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)試劑盒購(gòu)自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。將HEK-293T細(xì)胞均勻鋪于24孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層且密度達(dá)到80%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染體系中的共同成分為：300 μl DMEM、3 μl脂質(zhì)體、60 ng RL-TK質(zhì)粒；另依據(jù)試驗(yàn)?zāi)康牟煌?，分別向體系中加入0.6 μg IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、PRDⅢ/I-Luc或AP-1-luc報(bào)告質(zhì)粒，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)染空載體的空白對(duì)照。轉(zhuǎn)染24 h后，每孔加入100 HAU的SeV進(jìn)行刺激，同時(shí)設(shè)置不加病毒刺激的空白對(duì)照。病毒刺激12 h后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，離心后棄去細(xì)胞碎片，裂解獲得的上清液用于免疫印跡分析及熒光素酶活性測(cè)定試驗(yàn)。

1.2.2免疫印跡分析。裂解上清液與5×Loading buffer按照4∶1的比例混合，在沸水浴中煮10 min，樣品進(jìn)行蛋白電泳后，轉(zhuǎn)印至纖維素膜，進(jìn)行常規(guī)免疫印跡分析。其中，一抗使用flag鼠源單抗，二抗使用羊抗鼠IgG抗體,β-actin作為內(nèi)參蛋白。

1.2.3熒光素酶活性的測(cè)定。取裂解上清液20 μl，使用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)試劑盒測(cè)定其活性。

2 結(jié)果與分析

為了驗(yàn)證表達(dá)的蛋白能否抑制IFN-β啟動(dòng)子的活性，在不同蛋白表達(dá)的情況下測(cè)定IFN-β-luc報(bào)告基因的雙熒光素酶活性水平，當(dāng)SeV感染293T細(xì)胞時(shí)，IFN-β-luc的酶活性是未染毒空白對(duì)照的50倍左右，在表達(dá)蛋白P及W蛋白時(shí)酶活性并未被抑制；在V蛋白表達(dá)后，酶活性被顯著抑制(圖1)，表明APMV6的V蛋白能夠抑制IFN-β啟動(dòng)子的活性。為了闡明V蛋白發(fā)揮作用的區(qū)域，將表達(dá)V蛋白的質(zhì)粒與NF-κB-luc、PRDⅢ/I-luc、AP-1-luc的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，在SeV刺激條件下測(cè)定雙熒光素酶活性。結(jié)果表明，V蛋白能顯著抑制NF-κB啟動(dòng)子活性(圖2)，對(duì)PRDⅢ/I(圖3)和AP-1(圖4)啟動(dòng)子也有抑制作用，但不如對(duì)NF-κB啟動(dòng)子的抑制效果明顯。免疫印跡分析(Western blot)試驗(yàn)表明，重組蛋白能夠在293T細(xì)胞中表達(dá)，β-actin作為內(nèi)參蛋白，表明細(xì)胞數(shù)目之間并無(wú)差異(圖1～4)。

3 討論

目前，病毒對(duì)抗宿主先天免疫的機(jī)制研究已成為熱點(diǎn)，具有對(duì)抗功能的蛋白及對(duì)抗機(jī)制被不斷發(fā)現(xiàn)。關(guān)于禽6型副粘病毒分離的報(bào)道并不多見(jiàn)，更沒(méi)有關(guān)于該病毒對(duì)抗宿主先天免疫的研究，作為副粘病毒的一種，其對(duì)抗機(jī)制與其他已報(bào)道的副粘病毒是否相似尚存在差異，值得探討。筆者利用自主分離的1株APMV6，表達(dá)其P、V、W蛋白，用于對(duì)抗機(jī)制的研究。筆者首先發(fā)現(xiàn)V蛋白能夠抑制IFN-β啟動(dòng)子的活性，但并不清楚V蛋白作用于該啟動(dòng)子NF-κΒ、PRDⅢ/I、AP-1中的哪個(gè)部分。筆者進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)V蛋白對(duì)這3個(gè)部分都具有抑制作用，但對(duì)NF-κΒ啟動(dòng)子的活性顯著抑制。

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The V Protein of Avian Paramyxovirus Type 6 Antagonizes Beta Interferon Production of Host Cells

TIAN Zhi-ge, CHAI Hong-liang, HUA Yu-ping*

(Department of Wildlife Resource, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040)

[Objective] To study the mechanism of avian paramyxovirus type 6 V protein antagonizing beta interferon production. [Method] The study constructed the combine plasmids pCDNA-P, pCDNA-V, pCDNA-W for expressing protein P, V, W, respectively. The 293T cells were cotransfected with combine plasmids and report gene plasmids, after SeV stimulating, the firely luciferase and Renilla luciferase activities were determined. [Result] The V protein remarkably inhibited beta interferon production by decreasing the NF-κB activity. [Conclusion] The study clarified the mechanism of V protein antagonizing innate immunity of host cells preliminarily.

Prarmyxovirus; V protein; Antagonize; Beta interferon

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)(2572014AA03)；林業(yè)公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201404404)。

田志革(1985- )，女，黑龍江大慶人，博士研究生，研究方向：動(dòng)物病毒學(xué)及分子生物學(xué)研究。*通訊作者，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事野鳥(niǎo)疾病監(jiān)測(cè)與防治研究。

2014-11-24

S 852.65+7

A

0517-6611(2015)01-130-02