丁曉霞， 王世新， 姜 礅， 劉琦瑋, 孟昭軍

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040)

?

帽兒山異色瓢蟲(chóng)野外越冬前體內(nèi)CAT和SOD活性的變化

丁曉霞， 王世新， 姜 礅， 劉琦瑋, 孟昭軍*

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040)

[目的]了解自然條件下野外越冬前期異色瓢蟲(chóng)[Harmoniaaxyridis(Pallas)]體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的變化情況。[方法]定期采集野外越冬前期的異色瓢蟲(chóng)，并通過(guò)紫外分光光度法測(cè)定其CAT和SOD活性。[結(jié)果]CAT和SOD活性變化與溫度、相對(duì)濕度和晝長(zhǎng)變化均無(wú)顯著相關(guān)性；但2種酶活在11月2日之前均呈上升趨勢(shì)，而后至12月7日呈上升或下降波動(dòng)；CAT活性在11月16日達(dá)到最高峰，12月7日到達(dá)低谷；而SOD活性在11月2日和12月7日達(dá)到高峰，11月16日達(dá)到低谷，兩者變化呈互補(bǔ)性。[結(jié)論]當(dāng)溫度低于4.8 ℃、晝長(zhǎng)短于10.10 h時(shí)，異色瓢蟲(chóng)開(kāi)始滯育；而溫度達(dá)-9.0 ℃、晝長(zhǎng)短于8.70 h時(shí)，絕大多數(shù)異色瓢蟲(chóng)滯育越冬；在上述2個(gè)滯育點(diǎn)期間，異色瓢蟲(chóng)體內(nèi)CAT和SOD活性變化明顯，其活性大小可作為異色瓢蟲(chóng)滯育越冬的標(biāo)志。

異色瓢蟲(chóng)；越冬；自然種群；CAT；SOD

異色瓢蟲(chóng)屬鞘翅目瓢蟲(chóng)科,是農(nóng)林害蟲(chóng)的一種重要捕食性天敵, 對(duì)各類(lèi)蚜蟲(chóng)、某些蚧殼蟲(chóng)、粉虱、木虱、螨類(lèi)以及某些鱗翅目、鞘翅目害蟲(chóng)的卵和低齡幼蟲(chóng)具有控制作用,特別是對(duì)蚜蟲(chóng)的控制效果較好[1-2]，作為一種重要的生防天敵, 在全世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用[3]。 目前對(duì)異色瓢蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)種群的研究較多，但關(guān)于其自然種群在野外自然越冬的研究較少。在我國(guó)東北10、11月份有大量異色瓢蟲(chóng)遷飛到向陽(yáng)山坡石縫下以及建筑物的向陽(yáng)墻縫、窗戶(hù)縫及室內(nèi)越冬，但在東北的連續(xù)低溫下，個(gè)體死亡率很高[4]。因此，研究自然狀態(tài)下異色瓢蟲(chóng)越冬情況對(duì)保護(hù)異色瓢蟲(chóng)自然種群、發(fā)揮其自然控害作用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試?yán)ハx(chóng)。2013年10月7日至2014年5月11日，于東北林業(yè)大學(xué)帽兒山試驗(yàn)林場(chǎng)老爺嶺廢棄的木屋內(nèi)每14 d采集一次野外越冬異色瓢蟲(chóng)。將采集的瓢蟲(chóng)放在溫度為(25.0±1.5)℃、光周期為16∶8 h的光照培養(yǎng)箱中24 h后，選擇活動(dòng)自如的個(gè)體放在-42 ℃低溫冰箱保存供酶活測(cè)定。

1.1.2供試藥劑。0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH7.0,含1.00% PVP、0.04%苯基硫脲和10.00 mmol/L EDTA)；130.00 mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液；750 μmol/L NBT溶液；100 μmol/L EDTA溶液；20 μmol/L核黃素溶液。

1.2 方法

1.2.1CAT活性測(cè)定[11]。

1.2.1.1CAT酶液制備。將供試?yán)ハx(chóng)用預(yù)冷的含1.00% PVP、0.04%苯基硫脲、10 mmol/L EDTA的50 mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)在冰浴中用玻璃勻漿器研磨均勻，勻漿液于4 ℃、4 000 r/min離心15 min，取上清液用于酶活測(cè)定。

1.2.1.2CAT活性測(cè)定。取30% H2O20.5～0.6 ml，加水至50.0 ml，從中取出4.0 ml，加入0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)26.0 ml，測(cè)定240 nm波長(zhǎng)處OD值，如其OD值在0.50～0.55，即作為CAT的底物溶液。取已預(yù)溫至25 ℃的底物溶液3.0 ml，在25 ℃下加入粗酶液20 μl，立即測(cè)定240 nm波長(zhǎng)處的OD值，1 min后再測(cè)一次。

1.2.2SOD活性測(cè)定[12]。

1.2.2.1SOD酶液制備。同CAT酶液制備方法。

1.2.2.2SOD活性測(cè)定。按表1加入試劑。將3只試管于4 000 lx光照下反應(yīng)20 min(試管1遮光處理)后，全部置于暗處結(jié)束反應(yīng)。以不照光的對(duì)照管作空白，分別測(cè)定其他各管560 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

表1 SOD活性測(cè)定加樣 ml

1.2.3光周期晝長(zhǎng)的計(jì)算及室內(nèi)溫、濕度的測(cè)量。于百度網(wǎng)上查詢(xún)哈爾濱尚志、阿城及延壽3個(gè)地區(qū)(樣品采集地位于3個(gè)地區(qū)中間)在采樣日期的日出、日落時(shí)間，分別計(jì)算出其晝長(zhǎng)，然后取三地晝長(zhǎng)平均值作為采蟲(chóng)地點(diǎn)的晝長(zhǎng)數(shù)據(jù)。

在東北林業(yè)大學(xué)帽兒山試驗(yàn)林場(chǎng)老爺嶺廢棄的木屋(采樣地點(diǎn))內(nèi)安裝溫、濕度監(jiān)測(cè)儀，溫、濕度探頭懸在空中，距地面約1 m，溫濕度數(shù)據(jù)記錄頻率為1次/h，數(shù)據(jù)連續(xù)記錄到翌年5月中旬。計(jì)算采樣日期前3 d每天的溫、濕度數(shù)據(jù)平均值，將其分別作為采樣日期溫、濕度的3個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù)，再計(jì)算其均值作為采樣當(dāng)天的日平均溫度與日平均相對(duì)濕度的數(shù)據(jù)。

1.2.4野外異色瓢蟲(chóng)越冬前期未滯育情況調(diào)查。2013年10月7日至2014年5月11日，將每次采集的瓢蟲(chóng)隨機(jī)分為3份作為3個(gè)重復(fù)，放在溫度(25.0±1.5)℃、光暗周期為16∶8 h的光照培養(yǎng)箱24 h后，分別記錄活動(dòng)自如瓢蟲(chóng)的個(gè)體數(shù)及“死亡”(大多數(shù)滯育)的數(shù)量，然后統(tǒng)計(jì)每次采集瓢蟲(chóng)的未滯育率。

1.2.5數(shù)據(jù)處理。通過(guò)Excel表格統(tǒng)計(jì)酶活數(shù)據(jù)并做圖，利用SPSS17.0對(duì)前6次酶活數(shù)據(jù)與溫、濕度和晝長(zhǎng)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。CAT活性：KCAT=(2.303/60)×lg(OD1/OD2)×100，式中OD1為0 min時(shí)OD240值；OD2為1 min時(shí)OD240值。SOD活性：SOD[U/g(FW)]=(ACK-AE)×VT/(ACK×0.5×W×VS)，式中ACK表示2號(hào)對(duì)照管的吸光度；AE表示3號(hào)試驗(yàn)管的吸光度；VT表示樣品液總體積(ml)；W表示樣品重量(g)；VS表示測(cè)定時(shí)樣品用量(ml)。

2 結(jié)果與分析

2.1 野外異色瓢蟲(chóng)越冬前期未滯育調(diào)查由表2可知，在2013年11月2日之前，野外越冬異色瓢蟲(chóng)均未進(jìn)入滯育；在11月2～16日期間超過(guò)50%的越冬瓢蟲(chóng)進(jìn)入滯育；12月21日越冬瓢蟲(chóng)絕大多數(shù)進(jìn)入滯育。也就是在溫度低于4.8 ℃、晝長(zhǎng)時(shí)間短于10.10 h時(shí)，異色瓢蟲(chóng)開(kāi)始進(jìn)入滯育；在溫度接近1.0 ℃、晝長(zhǎng)時(shí)間達(dá)9.50 h時(shí)，超過(guò)50%的野外異色瓢蟲(chóng)進(jìn)入滯育越冬；在溫度達(dá)到-9.0 ℃、晝長(zhǎng)短于8.70 h時(shí)，絕大多數(shù)異色瓢蟲(chóng)進(jìn)入滯育越冬。2014年5月11日打破滯育的瓢蟲(chóng)數(shù)量未作統(tǒng)計(jì)。

表2 異色瓢蟲(chóng)越冬前期未滯育調(diào)查

2.2 異色瓢蟲(chóng)體內(nèi)CAT活性的變化與溫濕度、晝長(zhǎng)的關(guān)系由圖1可知，自2013年10月7日至11月16日，日平均溫度逐漸下降，在該過(guò)程中CAT活性隨溫度的下降而逐漸上升至越冬前的最高點(diǎn)(0.401 8)；在11月16～30日期間酶活相對(duì)穩(wěn)定；11月30日到12月7日，隨著溫度降低到冰點(diǎn)以下，CAT活性在12月7日大幅度下降達(dá)到越冬前的最低點(diǎn)(0.057 1)；但經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，CAT活性變化與溫度變化無(wú)相關(guān)性(r=0.246,P=0.639)。到2014年5月11日，隨著春天溫度的升高，CAT活性也逐漸增大。

相對(duì)濕度自2013年10月7日先下降，在10月19日有所上升，從11月2日開(kāi)始逐漸下降至12月7日，至次年5月11日又有所升高(圖2)。在11月16日之前，CAT活性逐漸升高，在11月30日，CAT活性變化很小而相對(duì)濕度劇烈下降，CAT活性變化與相對(duì)濕度無(wú)相關(guān)性(r=0.218,P=0.679)，至2014年5月11日CAT活性隨相對(duì)濕度升高而升高。

由圖3可知，晝長(zhǎng)隨日期呈線(xiàn)性變化，而CAT活性則是從2013年10月7日開(kāi)始升高至11月30日達(dá)到近似穩(wěn)定，在11月30日至12月7日CAT活性急劇下降，CAT活性變化與晝長(zhǎng)無(wú)相關(guān)性(r=-0.101,P=0.849)。至2014年5月11日晝長(zhǎng)顯著增加的同時(shí)CAT活性也有所上升。

2.3 異色瓢蟲(chóng)體內(nèi)SOD活性的變化與溫濕度、晝長(zhǎng)的關(guān)系由圖4可知，SOD活性先隨日平均溫度的迅速降低而大幅度升高，至11月2日酶活達(dá)最高值[256.1 U/g(FW)]；隨溫度繼續(xù)降低，至11月16日酶活到達(dá)最低值[52.4 U/g(FW)]，后隨溫度的下降SOD活性至12月7日又升到一個(gè)高度[128.3 U/g(FW)]；SOD活性變化與溫度呈低度相關(guān)(r=0.346,P=0.499)。至2014年5月11日隨溫度升高，SOD活性反而降低。

由圖5可知，2013年10月7日至11月2日相對(duì)濕度先下降后上升，而SOD活性則一直上升；11月2日至12月7日相對(duì)濕度持續(xù)下降，而SOD活性則先下降后上升；SOD活性變化與相對(duì)濕度無(wú)相關(guān)性(r=-0.042,P=0.937)。至2014年5月11日，相對(duì)濕度上升而SOD活性下降。

由圖6可知，2013年10月7日至12月7日，SOD活性在晝長(zhǎng)持續(xù)縮短的情況下先上升后下降再上升；SOD活性變化與晝長(zhǎng)呈低度相關(guān)(r=0.318,P=0.538)。2014年5月11日隨晝長(zhǎng)增加而SOD活性下降。

2.4 CAT與SOD活性變化的關(guān)系由圖7可知，在2013年10月7日至11月2日越冬剛開(kāi)始時(shí)，CAT和SOD活性都逐漸升高；而2013年11月2日至2014年5月11日期間，CAT和SOD活性呈相對(duì)互補(bǔ)性的升降變化，但統(tǒng)計(jì)表明CAT與SOD活性變化無(wú)相關(guān)性(r=-0.197,P=0.708)。

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，CAT和SOD活性變化與溫度、相對(duì)濕度和晝長(zhǎng)變化均無(wú)明顯相關(guān)性。但2種酶活在11月2日瓢蟲(chóng)越冬前期均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而后至12月7日呈上升或下降波動(dòng)；CAT活性在11月16日半數(shù)瓢蟲(chóng)進(jìn)入越冬期達(dá)到最高峰，12月7日瓢蟲(chóng)越冬期到達(dá)低谷；而SOD活性在11月2日瓢蟲(chóng)越冬前期及12月7日瓢蟲(chóng)越冬期達(dá)到高峰，11月16日半數(shù)瓢蟲(chóng)進(jìn)入越冬期達(dá)到低谷，兩者變化具有互補(bǔ)性。有研究表明，溫度對(duì)異色瓢蟲(chóng)的存活影響最大, 濕度次之, 溫濕度的交互作用不明顯[4]。該研究也表明，溫度(11月16日溫度接近冰點(diǎn)，而11月30日和12月7日溫度在冰點(diǎn)以下)對(duì)越冬前期異色瓢蟲(chóng)體內(nèi)CAT和SOD活性的影響較明顯。

對(duì)于不同種昆蟲(chóng)，其保護(hù)酶活力變化的趨勢(shì)有所不同[10]，甚至同種昆蟲(chóng)不同個(gè)體生命力的不同體現(xiàn)在酶活性上也存在差異[14]。同時(shí)，野外溫、濕度等條件的變化不像室內(nèi)呈規(guī)律性，也是造成該試驗(yàn)結(jié)果酶活性變化與幾種因子未達(dá)到顯著相關(guān)的原因。

[1] 王小藝，沈佐銳.異色瓢蟲(chóng)的應(yīng)用研究概況[J].昆蟲(chóng)知識(shí),2002, 39(4)：255-261.

[2] 李艷, 邵陽(yáng)光, 孫輝.異色瓢蟲(chóng)——簡(jiǎn)單而方便的遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)材料[J].生物學(xué)通報(bào), 2001, 36(3)：12-15.

[3] 王甦，張潤(rùn)志，張帆. 異色瓢蟲(chóng)生物生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，18(9)：2117-2126.

[4] 馬春森,何余容,張國(guó)紅,等.溫濕度對(duì)越冬異色瓢蟲(chóng)(Harmoniaaxyridis)存活的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào),1997,17(1)：23-28.

[5] 薛方森,魏洪義,朱杏芬.黑紋粉蝶滯育蛹體內(nèi)過(guò)氧化氫酶活力的研究[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào),1997,24(3)：204-208.

[6] 吳小鋒,徐俊良,崔為正.家蠶血淋巴超氧化物歧化酶活力及其影響因素[J].蠶業(yè)科學(xué),1997,23(1)：38-41.

[7] 吳小鋒,徐俊良,崔為正,等.家蠶血淋巴中過(guò)氧化物酶活力及其影響因素[J].蠶業(yè)科學(xué),1998,24(1)：36-38.

[8] 趙明，沈國(guó)清，陸貽通,等.低劑量吡蟲(chóng)啉對(duì)異色瓢蟲(chóng)的Hormesis效應(yīng)及其抗氧化酶活性的影響[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2012，33(4)：77-80.

[9] 岳雷,周忠實(shí),劉志邦,等.不同強(qiáng)度快速冷馴化對(duì)廣聚螢葉甲成蟲(chóng)耐寒性生理指標(biāo)的影響[J].昆蟲(chóng)學(xué)報(bào),2014,57(6)：631-638.

[10] 王滿(mǎn)囷,李周直.滯育期間鞭角華扁葉蜂保護(hù)酶系統(tǒng)活力[J].林業(yè)科學(xué),2002,38(4)：100-104.

[11] 曹傳旺,高彩球.昆蟲(chóng)生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)出版社,2009：51-52.

[12] 查黎春,胡春祥,曹傳旺,等.3種農(nóng)藥對(duì)天幕毛蟲(chóng)超氧化物歧化酶活性的影響[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,39(5)：105-107.

[13] 竇俊輝,喻樹(shù)迅,范術(shù)麗,等.SOD與植物脅迫抗性[J].分子植物育種，2010,8(2)：359-346.

[14] 李健男,夏潤(rùn)璽,劉勤,等.柞蠶血液過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的研究[J].沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,31(4)：337-339.

[15] 楊光平,劉玉娣,侯茂林.二化螟滯育幼蟲(chóng)的蛋白和核酸含量以及保護(hù)酶活性的變化[J].昆蟲(chóng)學(xué)報(bào),2013,56(3)：251-256.

[16] 劉流,賀莉芳,劉暉,等.滯育家蠅幼蟲(chóng)氨基酸、SOD、CAT的變化[J].四川動(dòng)物,2009,28(4)：579-581.

[17] 方允中,李文杰.自由基與酶基礎(chǔ)理論及其在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[M].北京:科學(xué)出版社, 1989.

The Changes of SOD and CAT Activity ofHarmoniaaxyridisbefore Natural Wintering in the Maoershan Mountain

DING Xiao-xia, WANG Shi-xin, JIANG Dun, MENG Zhao-jun*et al

(College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040)

[Objective] The changes of SOD and CAT activity were researched forHarmoniaaxyridisbefore natural wintering. [Method]H.axyridiswas regular collected and their SOD and CAT activity were determined by UV spectrophotometer. [Result]The results showed there is no significant correlation to the changes of SOD and CAT activity with temperature, relative humidity and daylength. Then SOD and CAT activity added before November 2, 2013 and added or reduced from November 2 to December 7, 2013. CAT activity was the biggest on November 16, 2013 and was the smallest on December 7, 2013. While SOD activity was bigger on November 2 and December 7, 2013 and was the smallest on November 16, 2013. The complementarity appeared in the changes of SOD and CAT activity. [Conclusion] The results foundedH.axyridisbegan to enter a diapause when it was under 4.8 ℃ and the daylength was less than 10.10 h. Then most ofH.axyridisentered a diapause and wintered when it was -9 ℃ and the daylength was less than 8.70 h. The changes of SOD and CAT activity ofH.axyridiswere significant in the above two points during diapauses and SOD and CAT activity was regarded as the symbol ofH.axyridisentering into diapauses and wintering.

Harmoniaaxyridis(Pallas); Overwintering; Natural population; Catalase(CAT); Superoxide dismutase(SOD)

東北林業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201310225009)。

丁曉霞(1992-)，女，四川雙流人，本科生，專(zhuān)業(yè)：森林資源保護(hù)與游憩。*通訊作者，講師，博士，從事昆蟲(chóng)化學(xué)生態(tài)與害蟲(chóng)生物防治研究。

2014-11-25

S 718.7

A

0517-6611(2015)02-144-04