劉宇峰，王玥明，楊慶麗，姬妍茹，董 艷，石 杰

(黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶 163319)

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耐高溫飼用酵母菌種的篩選

劉宇峰，王玥明，楊慶麗，姬妍茹，董 艷，石 杰

(黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶 163319)

[目的]篩選出可適于配合型生物飼料高溫加工需要的酵母菌株。[方法]通過(guò)對(duì)國(guó)家允許使用的酵母菌6株進(jìn)行高溫?fù)p傷耐受性試驗(yàn)和高活性培養(yǎng)條件的研究。[結(jié)果]篩選到可耐受45 ℃高溫并保持108個(gè)/ml的高活菌數(shù)的菌株2株DQFC2117-1和DQFC2122-2。[結(jié)論]篩選出的菌株DQFC2117-1和DQFC2122-2可作為配合型生物飼料加工所需要的耐高溫酵母菌株。

耐高溫；飼用酵母；配合型；生物飼料

我國(guó)目前企業(yè)生產(chǎn)的酵母生產(chǎn)工藝從初期的吸附法的壓榨酵母(含水量20%)到20世紀(jì)80年代的氣流干燥普通活性干酵母(含水量8%)，至目前的快速低溫干燥技術(shù)的速效活性干酵母(含水量4%～5%)，均屬于真空包裝的活性干酵母類(lèi)型[1]。因此，尚無(wú)法突破飼料行業(yè)在生物飼料的配合型終端生物飼料產(chǎn)品的粗放性的加工、造粒所遭受的機(jī)械損傷及粗放保存、長(zhǎng)途運(yùn)輸和粗放使用而導(dǎo)致的活力損傷的技術(shù)瓶頸，這些產(chǎn)品往往在加工過(guò)程中其生物活性就幾乎全部損失[2]，因此在很大程度上限制了活性酵母在生物飼料領(lǐng)域的應(yīng)用和拓展。因此，可耐受粗放條件的飼用活性酵母產(chǎn)品的技術(shù)研發(fā)問(wèn)題就被客觀地突顯出來(lái)。筆者選育出高活性和耐高溫的飼用酵母菌種，以期為今后研究高活性、耐高溫、耐造粒、耐貯運(yùn)的直投式飼用酵母添加劑新產(chǎn)品奠定重要的菌種基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種。飼用酵母菌DJ-1，分離自大連興和飼用活性干酵母產(chǎn)品；產(chǎn)朊假絲酵母，由黑龍江省科學(xué)院微生物所惠贈(zèng)； 釀酒酵母，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院惠贈(zèng)； 釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeAS2.300 FFCC2117和FFCC2167、 產(chǎn)朊假絲酵母Candidautilis,AS2.1028 FFCC2122，均由大連工業(yè)大學(xué)惠贈(zèng)。

1.1.2培養(yǎng)基。馬鈴薯培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、豆芽汁培養(yǎng)基；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)化學(xué)純。馬鈴薯和大豆均采用東北優(yōu)質(zhì)材料。

1.2 儀器數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱，型號(hào)HPX—9082MBE，為上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)產(chǎn)品；振蕩培養(yǎng)箱，型號(hào)HZQ—X100，為哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品；生物安全柜，型號(hào)BSC-1360ⅡA2，為北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器，為型號(hào)LDZX—40SCI，為上海申安醫(yī)療儀器廠(chǎng)產(chǎn)品；生物顯微鏡，型號(hào)BK-5000，為重慶奧特光學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，型號(hào)UV-759，為上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；酸度計(jì)，為上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1純化與分離。將已收集的6株飼用酵母采用麥芽汁瓊脂平板法28 ℃下培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌種純化。對(duì)具有酵母典型性形態(tài)的單菌落進(jìn)行觀察；以無(wú)菌水洗下斜面培育的釀酒酵母菌苔，制成菌懸液， 取0.05%美藍(lán)染色液1滴，置于載玻片中央，并用接種環(huán)取酵母菌懸液與染色液混勻，染色2～3 min，加上蓋玻片，置于高倍鏡下觀察酵母菌個(gè)體形態(tài)，進(jìn)行顯微鏡檢定。最后，將具有典型性的單菌落劃線(xiàn)至麥芽汁固體斜面培養(yǎng)基上保存?zhèn)溆肹3]。

1.3.2適宜培養(yǎng)基的初步篩選。將已純化分離出的6株飼用酵母斜面菌分別接種于馬鈴薯培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基和豆芽汁培養(yǎng)基4種酵母常用的液體培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)24 h，以平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)酵母的活菌數(shù)為指標(biāo)，確定各菌株適宜的培養(yǎng)基。

1.3.3耐高溫酵母菌株的菌種誘變及篩選。將培養(yǎng)好的6株酵母斜面作為出發(fā)菌株，進(jìn)行Co60放射物理誘變，照射劑量為3 000 Gy。將誘變后的斜面菌全部洗脫至各菌株適宜的液體培養(yǎng)基中，以出發(fā)菌株為對(duì)照，分別于40、45和50 ℃震蕩培養(yǎng)24 h，采用平板法篩選出生長(zhǎng)較旺盛的酵母菌株，劃入各菌株適宜的斜面培養(yǎng)基， 4 ℃下保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼用酵母菌種的分離與純化通過(guò)對(duì)6株飼用酵母在麥芽汁瓊脂平板法上的單菌落形態(tài)的觀察和顯微鏡檢定，分離出菌落飽滿(mǎn)、生長(zhǎng)快且具有酵母典型性形態(tài)的菌株各2株。

從表1可以看出，所收集的6株菌株菌符合酵母菌的典型特性，并經(jīng)純化后獲得了12株酵母純菌株。

表1 分離純化出的飼用酵母菌株的菌落特征

2.2 適宜的酵母培養(yǎng)基篩選將6株酵母分別純化出的菌株6株按1%接種量分別接種于100 ml馬鈴薯培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基和豆芽汁培養(yǎng)基4種酵母常用液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 震蕩培養(yǎng)24 h 后，分別采用平板活菌數(shù)計(jì)數(shù)法測(cè)定酵母菌的生成量，以確定培養(yǎng)基的適宜情況。

從表2可以看出，飼用酵母DQDJ-1較適宜的培養(yǎng)基為馬鈴薯培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基；產(chǎn)朊假絲酵母DQCR-1 較適宜的培養(yǎng)基為馬鈴薯培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基；釀酒酵母DQDN-2 適宜的培養(yǎng)基是麥芽汁培養(yǎng)基；產(chǎn)朊假絲酵母DQFC2122-1和釀酒酵母DQFC2117-1適宜的培養(yǎng)基都是馬鈴薯培養(yǎng)基； 釀酒酵母DQFC2167-1適宜的培養(yǎng)基為馬鈴薯培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基。

表2 6株酵母在不同液體培養(yǎng)基中的活菌數(shù) CFU/ml

注：**表示差異極顯著(P<0.01)；*表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 耐高溫酵母菌株的菌種誘變及篩選將經(jīng)過(guò)劑量3 000 Gy的Co60放射物理誘變的6株酵母，以出發(fā)菌株為對(duì)照，分別經(jīng)40、45、50 ℃培養(yǎng)24 h的高溫條件篩選后，采用平板法測(cè)定存活的菌數(shù)，并經(jīng)誘變前后方差分析后,篩選出可以顯著耐受高溫的酵母菌株。

從表3可以看出，經(jīng)過(guò)誘變后DQFC2117-1和DQFC2122-1菌株在馬鈴薯培養(yǎng)基上存活的菌落數(shù)與出發(fā)對(duì)照株相比有顯著性提高，可以耐受45 ℃的培養(yǎng)溫度。2株菌株光學(xué)及電子顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖1～4。

表3 可耐高溫生長(zhǎng)的酵母菌株的活菌數(shù) CFU/ml

注：**表示差異極顯著(P﹤0.01)；*表示差異顯著(P﹤0.05)，-表示無(wú)生長(zhǎng)。

3 結(jié)論與討論

該研究以具有提高含脂量和生香味的釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeAS2.300 FFCC2117和可提高蛋白含量的食用及飼料酵母-產(chǎn)朊假絲酵母CandidautilisAS2.1028 FFCC2122為出發(fā)點(diǎn)菌株，通過(guò)誘變和篩選，得到2株可耐受45 ℃的高培養(yǎng)溫度的菌株DQFC2117-1、DQFC2122-1，突破了以前作為飼料工業(yè)允許使用的釀酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母的25～28 ℃液體培養(yǎng)的經(jīng)典培養(yǎng)模式，為今后進(jìn)一步研究耐高溫、耐造粒、耐貯運(yùn)的高活性直投式飼用酵母添加劑新產(chǎn)品奠定了重要的耐高溫菌種的研究基礎(chǔ)。

微生物廣泛存在于自然界，至今已發(fā)現(xiàn)大量極端微生物，如極端嗜鹽菌和極端嗜酸、嗜熱的菌[4]。嗜熱微生物(Thermophiles)是一種能在高于40～50 ℃溫度下生長(zhǎng) ，最適生長(zhǎng)溫度為55～65 ℃，最高生長(zhǎng)溫度80 ℃的微生物。發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用的德氏乳酸桿菌的最適生長(zhǎng)溫度為45～50 ℃，嗜熱糖化芽孢桿菌為65 ℃。關(guān)于嗜熱微生物能在高溫環(huán)境中生存的原因，有人認(rèn)為是胞內(nèi)酶和蛋白質(zhì)分子中1個(gè)或多個(gè)部位被某些氨基酸所取代，能以特殊的方式折疊，導(dǎo)致抵抗溫度的變性作用胞內(nèi)酶和蛋白質(zhì)在高溫時(shí)更穩(wěn)定。另外，細(xì)胞質(zhì)膜富含飽和脂肪酸，因而膜在高溫下仍很穩(wěn)定并發(fā)揮功能。tRNA在特定的堿基區(qū)域含較多GC對(duì)，使其核酸有熱穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)。但是，以前研究的嗜熱微生物大部分為細(xì)菌，常見(jiàn)于溫泉、熱泉、火山噴氣口、海底火山噴氣口、堆肥，在食品發(fā)酵工業(yè)應(yīng)用中較為少見(jiàn)。2011年徐大鵬等[5]在乙醇發(fā)酵的菌中篩選到1株可在41 ℃下良好生長(zhǎng)的耐高溫產(chǎn)酒精酵母菌，證實(shí)了耐高溫酵母菌的真實(shí)存在，也為該研究提供了耐高溫飼用酵母菌篩選成功的有力佐證。該研究可為今后耐高溫酵母菌在生物飼料及其他應(yīng)用領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。

[1] 張建峰,耿宏偉,王丕武.釀酒活性干酵母生產(chǎn)工藝優(yōu)化及干燥劑的選擇[J].食品科學(xué)，2011(9):213-216.

[2] 胡彬.活性干酵母行業(yè)發(fā)展瓶頸與對(duì)策[J].中國(guó)食品工業(yè)，2006(7):20-21.

[3] 于景芝.酵母生產(chǎn)與應(yīng)用手冊(cè)[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2005:20-400.

[4] 沈萍.微生物學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2000:1-30.

[5] 徐大鵬,李云杰,張栩,等.耐高溫酵母菌的篩選及特性[J].生物加工過(guò)程，2011(3):17-21.

Screening of High Temperature Resistant Forage Yeast Strains

LIU Yu-feng, WANG Yue-ming, YANG Qing-li et al

(Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences, Daqing, Heilongjiang 163319)

[Objective] To filter out yeast strains adapt to fit the need of biological feed with high temperature processing. [Method] By using yeast to the state allows the use of 6 lines to study condition and high temperature damage tolerance culture experiment in high activity. [Result] DQFC2117-1 and DQFC2122-2 obtained can withstand high temperature of 45 ℃ and the high number of live cells108 cfu/ml strains. [Conclusion] The screened strains DQFC2117-1 and DQFC2122-2 can be used as strain yeast for biological feed processing.

High temperature resistance; Feed yeast; Fit type; Biological feed

黑龍江省財(cái)政廳基本應(yīng)用技術(shù)研究專(zhuān)項(xiàng)。

劉宇峰(1963-)，女，遼寧丹東人，研究員，從事微生物飼料研究。

2014-11-19

S 816.6

A

0517-6611(2015)02-086-02