鮑 銳，吳世良，王松華

(安徽科技學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

不同有機(jī)碳源對(duì)靈芝液體發(fā)酵靈芝酸生產(chǎn)的影響

鮑 銳，吳世良，王松華*

(安徽科技學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

目的：研究不同有機(jī)碳源對(duì)靈芝液體發(fā)酵靈芝酸生產(chǎn)的影響。方法：研究不同濃度的玉米粉、小麥粉、蕎麥粉下靈芝液體發(fā)酵菌絲體干重、靈芝酸含量及產(chǎn)量。結(jié)果：培養(yǎng)基玉米粉濃度4g/L時(shí)，菌絲體干重和靈芝酸產(chǎn)量分別達(dá)到最大值，較對(duì)照組提高了1.11和1.26倍；培養(yǎng)基小麥粉濃度10g/L時(shí)，干重和產(chǎn)量分別比對(duì)照組提高了0.73和0.87倍；培養(yǎng)基蕎麥粉濃度7g/L時(shí)，干重和產(chǎn)量分別比對(duì)照組提高了0.97和1.15倍。培養(yǎng)基玉米粉濃度7g/L時(shí)，靈芝酸含量達(dá)到最大值23.538mg/g。培養(yǎng)基中玉米粉濃度為4、5、7、10g/L時(shí)，靈芝酸產(chǎn)量差異不顯著。結(jié)論：從生產(chǎn)實(shí)際考慮，應(yīng)使用4g/L的玉米粉優(yōu)化培養(yǎng)基。

有機(jī)碳源；液體發(fā)酵；靈芝酸；菌絲體干重；含量；產(chǎn)量

隨著社會(huì)生產(chǎn)的發(fā)展，人們對(duì)靈芝的深入研究，靈芝的藥用價(jià)值得到極速的提升，尤其靈芝中的靈芝酸與多糖，對(duì)人體具有極大的益處[1-2]。靈芝多糖具有降血糖[2]、抗腫瘤[3]、調(diào)節(jié)免疫[4]等方面具有重要作用，而靈芝酸具有保肝抗病毒的功能作用[5-7]。有機(jī)物是生命物質(zhì)產(chǎn)生的基礎(chǔ)，對(duì)生物的正常生長(zhǎng)和代謝具有重要的作用，玉米、小麥、蕎麥作為復(fù)合有機(jī)物碳源，研究表明：復(fù)合有機(jī)碳源比一般單糖(葡萄糖)，二糖(麥芽糖、蔗糖)更有益于液體發(fā)酵中菌絲體的生長(zhǎng)[8-9]。本試驗(yàn)研究玉米粉、小麥粉、蕎麥粉對(duì)靈芝液體發(fā)酵中菌絲體生物量、靈芝酸含量與產(chǎn)量的影響，篩選出靈芝發(fā)酵最佳碳源。

1 材料與方法

1.1 菌種

由上海農(nóng)科院食用所提供，由本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存。

1.2 培養(yǎng)基配制與培養(yǎng)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 PDA培養(yǎng)基制備(500mL)：馬鈴薯100g加蒸餾水煮開至10～15min，除去馬鈴薯殘?jiān)?，加蔗?0g、瓊脂 7.5g溶解；

種子液培養(yǎng)基制備(500mL)：馬鈴薯100g、蔗糖10g、酵母膏1.25g、七水硫酸鎂1.5g、磷酸二氫鉀2.4g、魚粉蛋白胨1.25g；

擴(kuò)大培養(yǎng)基制備(1000mL)：磷酸二氫鉀1g、硫酸鎂1g、葡萄糖20g、魚粉蛋白胨10g。

1.2.2 培養(yǎng)方法 靈芝斜面菌種活化：從母種斜面切除小拇指塊狀的菌種接與斜面中部，放在恒溫恒濕箱28℃下培養(yǎng)7d，放到4℃冰箱保存；

種子液培養(yǎng)：取斜面菌種一支，將其菌種接種到250mL三角瓶(裝液量100mL),于恒溫?fù)u床28℃、轉(zhuǎn)速150r/min培養(yǎng)7d，于冰箱4℃保存；

擴(kuò)大培養(yǎng)：用高速分散器將種子液打碎，移液槍取5mL到250mL三角瓶(裝液量100mL),恒溫?fù)u床培養(yǎng)7d。

1.3 試劑配制

5%冰乙酸-香草醛：準(zhǔn)確稱取香草醛5g,冰乙酸溶解并定容到100mL,即為5%冰乙酸-香草醛；

熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線:準(zhǔn)確稱取烘干至恒重的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品8.0mg，無(wú)水乙醇溶解并定容100mL，即為0.08mg/mL熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

采用單因素分別研究了不同濃度的玉米粉、小麥粉、蕎麥粉對(duì)靈芝液體發(fā)酵的影響。

1.5 分析及測(cè)定方法

1.5.1 熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 取試管7支，依次加入熊果酸標(biāo)準(zhǔn)液0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mL，并加5%冰乙酸-香草醛0.5mL和高氯酸0.8mL，密封水浴60℃,15min后取出，冰水混合冷卻3min,依次加入冰乙酸5、2.95、2.90、2.85、2.80、2.75、2.70mL， 548nm下測(cè)其吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.0117x-0.0018,R2= 0.9992。

1.5.2 菌絲體生物量測(cè)定 用紗布過(guò)濾沉淀物，并洗滌沉淀物3～5次，于60℃烘箱中烘干，并稱其干重。

1.5.3 靈芝酸的提取與測(cè)定 研磨菌絲體并稱取0.10g，加入無(wú)水乙醇10mL,放入到超聲波震蕩器震蕩3h，取上清液5.0mL，6000r/min，離心10min。取樣品液0.20mL加入5%冰乙酸-香草醛0.50mL、高氯酸0.80mL密封，60℃水浴15min。再加入冰乙酸2.80mL，搖勻測(cè)吸光度，通過(guò)熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線算出胞內(nèi)酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米粉對(duì)靈芝液體發(fā)酵的影響

將不同濃度的玉米粉分別加入到擴(kuò)大培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7d收獲。結(jié)果表明，玉米粉對(duì)靈芝菌絲體生物量(圖1)和靈芝酸產(chǎn)量(圖3)影響較顯著。對(duì)于靈芝酸含量，玉米粉濃度在7g/L時(shí)，與對(duì)照組相比，差異顯著(圖2)。當(dāng)玉米粉濃度達(dá)到4g/L時(shí)，其菌絲體生物量與靈芝酸產(chǎn)量分別達(dá)到12.434g/L和238.654mg/L，分別是對(duì)照組的2.11、2.26倍。

2.2 小麥粉對(duì)靈芝液體發(fā)酵的影響

小麥粉按照不同濃度添加到擴(kuò)大培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7d收獲。結(jié)果表明，小麥粉對(duì)靈芝菌絲體生物量(圖4)和靈芝酸產(chǎn)量(圖6)影響較顯著，而對(duì)于靈芝酸含量基本沒有影響(圖5)。在小麥粉7個(gè)組別中，小麥粉濃度為1、3、4、5、7g/L組間菌絲體生物量與靈芝酸產(chǎn)量差異不顯著，濃度為10g/L時(shí)，菌絲體生物量與靈芝酸產(chǎn)量達(dá)到最大值，分別為對(duì)照組1.73、1.87倍。

2.3 蕎麥粉對(duì)靈芝液體發(fā)酵的影響

將不同濃度的蕎麥粉依次加入到擴(kuò)大培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7d收獲。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，蕎麥粉對(duì)靈芝菌絲體生物量(圖7)和靈芝酸產(chǎn)量(圖9)影響較顯著，而對(duì)于靈芝酸含量基本沒有影響(圖8)。當(dāng)培養(yǎng)基中加入4g/L蕎麥粉時(shí)，其菌絲體生物量與濃度為1、3g/L比較，差異顯著，與5、7、10相比，差異不顯著。

2.4 玉米粉、小麥粉、蕎麥粉對(duì)靈芝液體深層發(fā)酵的比較

相同情況下相比較，加入玉米粉4g/L比小麥粉、蕎麥粉的菌絲體生物量增加顯著，且達(dá)到最大值12.434g/L；小麥粉、蕎麥粉菌絲體生物量呈上升趨勢(shì)，并且濃度在1、3、4、5、7g/L蕎麥粉菌絲體生物量顯著高于小麥粉(圖10)。

培養(yǎng)基中加入玉米粉為7g/L的實(shí)驗(yàn)組，靈芝酸含量要顯著高于添加相同濃度的小麥粉與蕎麥粉試驗(yàn)組，且達(dá)到最大值23.538mg/g(圖11)。培養(yǎng)基中玉米粉濃度為4、5g/L試驗(yàn)組靈芝酸產(chǎn)量均顯著高于同濃度小麥粉、蕎麥粉試驗(yàn)組(圖12)。培養(yǎng)基中玉米粉濃度為4、5、7、8g/L試驗(yàn)組靈芝酸產(chǎn)量差異不顯著。相同濃度下，靈芝酸產(chǎn)量蕎麥粉試驗(yàn)組要高于小麥粉試驗(yàn)組。

3 結(jié)論與討論

碳源作為靈芝生長(zhǎng)代謝的主要物質(zhì)之一，為菌絲體提供碳源骨架和生命活動(dòng)所需要的能量，靈芝菌絲體生長(zhǎng)對(duì)于不同的碳源的利用效率是不同的[10]。而玉米粉、小麥粉、蕎麥粉作為一種復(fù)合有機(jī)碳源，都含有大量的蛋白質(zhì)和淀粉。玉米粉含有脂肪、維生素B2、磷元素、亞油酸、維生素E和較多的鈣、鐵、硒元素；小麥粉中富含脂肪、維生素、碳水化合物、礦物質(zhì)(鈣、鐵、磷、鉀等)；蕎麥粉富含維生素E、元素(鐵、鎂、鋅等)以及某些黃酮。不僅為菌絲體的生長(zhǎng)提供所需碳源外，而且也能夠提供其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，研究表明鈣離子在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起著重要的作用[11-12]；

本研究表明，使用玉米粉、小麥粉、蕎麥粉優(yōu)化培養(yǎng)基，可以提高靈芝菌絲體的生長(zhǎng)，但對(duì)于靈芝酸的含量影響并不明顯。研究結(jié)果表明培養(yǎng)基中加入玉米粉4g/L可以顯著提高菌絲體生物量111%，達(dá)到12.434g/L,靈芝酸產(chǎn)量238.654mg/L；培養(yǎng)基中加入小麥粉10g/L可以提高菌絲體干重73%,達(dá)到10.196g/L，靈芝酸產(chǎn)量199.698 mg/L；培養(yǎng)基中加入蕎麥粉7g/L可以提高菌絲體干重97%，達(dá)到11.637g/L，靈芝酸產(chǎn)量227.125mg/L。

此外，可以得出玉米粉、小麥粉、蕎麥粉對(duì)于靈芝液體發(fā)酵影響存在差異性，玉米粉對(duì)于提高靈芝酸的產(chǎn)量更有效。有研究[9]表明復(fù)合碳源比一般單一碳源產(chǎn)量高的原因可能是復(fù)合碳源含有葡萄糖、蛋白質(zhì)、多種礦物質(zhì)以及微量元素，更有利于菌絲體的生長(zhǎng)。目前，有關(guān)復(fù)合碳源在靈芝液體發(fā)酵中應(yīng)用報(bào)道較少，尤其是相關(guān)作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。在今后規(guī)模化靈芝液體發(fā)酵生產(chǎn)靈芝酸中，選擇玉米粉作為發(fā)酵過(guò)程中的主要碳源，可以更有效的提高靈芝酸的產(chǎn)量。

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(責(zé)任編輯：李孟良)

Effects of Different Organic Carbon Sources on the Production of Ganodermic Acid form Liquid Fermentation of Ganoderma Lucidum

BAO Rui,WU Shi-liang, WANG Song-hua*

(College of Life Science，Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang 233100，China)

Objective：It aims to investigate the effects of different organic carbon sources on the production ofganodermic acid from liquid fermentation of Ganoderma lucidum. Method: Research on different concentrations of the corn flour,wheat flour,buckwheat powder,which influence the Mycelium dry weight,yield of ganoderic acid and content of ganoderic acid form submerged fermentation of Ganoderma lucidum was done. Results:The Mycelium dry weight and yield of ganoderic acid in mycelia were up-regulated by 111% and 126%,respectively, compared with the control group when the concentration of corn flour was 4g/L in culture solution. The Mycelium dry weight and yield of ganoderic acid in mycelia were up-regulated by 73% and 87%,respectively, compared with the control group when the concentration of wheat flour was 10g/L in culture solution. The Mycelium dry weight and yield of ganoderic acid in mycelia were up-regulated by 97% and 115%,respectively, compared with the control group when the concentration of buckwheat powder was 7g/L in culture solution. The content of ganoderic acid in mycelia reached peak, being 23.538mg/g, when 4g/L of corn flour was added to medium. However, there is no significant difference in the yield of ganoderic acid between 4, 5,7 and 10g/L of wild corn flour. Conclusion: From the practical considerations, 4g/L of corn flour was selected to apply to further experiment.

Organic carbon source; Liquid fermentation; Ganoderma acid; Mycelium dry weight; Content; Yield

2015-07-20

安徽省自然科學(xué)基金(11040606M96)。

鮑銳(1992-)，男，安徽省六安市人，在讀碩士研究生，主要從事靈芝液體發(fā)酵研究。*通訊作者：王松華，教授，E-mail：shwang70。

S641.3

A

1673-8772(2015)06-0071-06